基于质谱的疾病标记物高灵敏度生物传感新方法研究

发布时间：2017-12-07 19:00

  本文关键词：基于质谱的疾病标记物高灵敏度生物传感新方法研究

  更多相关文章： 质谱 核酸 蛋白质 疾病标记物 DNA甲基化 DNA重复序列 脂质体 信号放大 单粒子计数

【摘要】：近年来,生物传感与生化分析新方法的研究进展,极大地推动了分析化学与生命科学的学科发展,在分析化学和生命科学的交叉领域,无论在科学研究方面还是实际应用都发挥着越来越重要的作用。质谱技术是近些年来发展迅速的生物分析技术之一。质谱作为生物活性分子的检测手段,具有多种优点:高灵敏度,可测定纳摩尔以下物质的量;快速,数分钟内即可完成测试;能同时提供精确分子质量和结构信息;既可以定性分析,也可以用于定量分析;有效地与各种色谱分离技术联用。质谱的特点可以概括为灵敏、快速、专一、高通量,充分展示了质谱比其它方法优越。本论文以质谱为研究平台,建立了多种生物传感新方法。以具有重要生物功能和研究意义以及重大疾病相关的生物标志物为研究对象,发展了一系列简单、快速、成本低、稳定性好,且具有高灵敏度、高选择性和高通量的新型生物传感方法。研究论文的主要内容如下:第2章提出了DNA目标序列碎片化质谱检测DNA甲基化水平的方法。无需经过链扩增方法,将目标DNA链水解后释放出单个碱基,单个碱基的质谱灵敏度远高于DNA链的质谱灵敏度。纳升电喷雾离子源(Nano ESI)的流速远低于毫升/分钟,离子化效率同时得到大大提高。结合Nano ESI,DNA水解物由流动注射直接进样并质谱检测,5-甲基胞嘧啶(5m C)的检出限达0.11 p M。采用经济的甲酸水解法,水解效率高,便于实现。DNA水解物混合溶液无需经过色谱分离即可高灵敏度检测,实验操作过程简单,快捷。以前列腺癌相关基因的Cp G岛特定序列为研究对象,通过质谱准确测定了20个临床组织样本的甲基化水平。第3章将目标序列碎片化质谱检测的方法应用到DNA重复序列拷贝数的检测中。重复序列的动态突变不仅可以发生在上代的生殖细胞中从而遗传至下一代,也可在当代的体细胞中发生突变。研究已发现,重复序列的动态突变与多种神经性疾病相关,是当前研究热点之一。利用PCR扩增方法提高目标重复序列的浓度,PCR引物上标记生物素。链霉亲和素磁珠与PCR产物中的生物素结合,目标重复序列被磁珠捕获纯化。随后,目标重复序列从磁珠上释放下来,甲酸水解。得到的水解物以质谱检测,胞嘧啶碱基的检测限为18.23 f M。测定单个CAG拷贝数时,所需基因组DNA最小量为0.07μg,完全满足临床检测要求。第4章以脂质体纳米粒子对蛋白质疾病标记物进行标记,实现蛋白质的高灵敏度免疫质谱检测。蛋白质疾病标记物在临床医学上具有非常重要的作用,是指示疾病发生、疾病状态以及疾病变化的重要指标。但是一些蛋白质含量非常低,特别是在血液、尿液等基质复杂的样品中,检测难度大。磷脂酰胆碱类磷脂易于电离,质谱灵敏度高。将其制备成脂质体,并对目标蛋白质进行标记编码,不仅可以对目标蛋白进行信号放大,也可以同时检测多组分目标蛋白质。通过磁珠捕获临床样本中待测蛋白质,并加入已标记检测抗体的脂质体,得到免疫夹心复合物。无需移去磁珠,以基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)直接检测磁珠上的脂质体,从而得知目标蛋白质的浓度。前列腺特异性抗原(PSA)与癌胚抗原(CEA)的检出限分别为0.03 ng/m L和0.2 ng/m L,能够有效区分临床正常值与异常值,在临床样本的检测中也证实了方法的可行性。质谱提供的精确质量数提高了对蛋白质的鉴定能力,避免了酶联免疫吸附测定(ELISA)所存在的假阳性结果。第5章开发了目标核酸的超灵敏质谱计数检测方法。在疾病症状尚未出现前,人体中已存在极微量的核酸生物标记物,是临床上极为重要的诊断指标。但是,现有的分析方法难以检测到超低含量的核酸标记物。可见,建立超灵敏的核酸检测方法显得尤为迫切以及重要。脂质体具有信号放大功能,单个脂质体产生一个质谱信号峰。磁珠捕获目标核酸后,利用脂质体对目标核酸进行标记,一个脂质体对应一条核酸链。光照条件下,捕获链上的光裂解基团发生断裂,脂质体从磁珠上释放出来。利用质谱对脂质体进行计数分析,进而得知目标核酸链的数量。所建立的方法实现了单分子水平核酸链(10-18 M)的检测,可以应用到超低含量核酸生物标记物的检测。文中检测了临床样本中丙肝(HCV)病毒的RNA拷贝数。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.63;TP212.3

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本文编号：1263400