DNA修复酶活性检测的荧光生物传感方法研究

发布时间：2017-12-24 12:16

  本文关键词：DNA修复酶活性检测的荧光生物传感方法研究　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：DNA修复酶能参与DNA损伤的修复过程,保护基因组免受DNA损伤的危害,进而维持基因组的完整性。DNA修复酶活性的异常将对DNA损伤的修复过程产生干扰,从而导致各种疾病,包括早熟衰老症、发育障碍、肿瘤、神经退化性疾病等。因此,对DNA修复酶活性的检测,有利于在功能研究和临床诊断中评价DNA损伤的修复过程。近年来,由于具有操作简捷、生物相容性好等优点,基于DNA的荧光生物传感方法已成为定量检测生物分子的常用分析方法。这种方法将DNA作为识别探针来对特定的目标物进行识别,并能将该识别事件转换成可以检测的荧光信号。目前,基于DNA的荧光生物传感方法已被用于DNA修复酶的活性检测中。然而,这些方法仍存在一些不足：1)需要标记或修饰,以及灵敏度低；2)需要同时移除多个损伤碱基才能实现信号的转导,限制了灵敏度的提高；3)每种方法只能对一种DNA修复酶的活性进行检测,不足以评价DNA损伤的修复过程。本论文发展了检测DNA修复酶活性的新型荧光生物传感方法。其中,尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、内切酶Ⅳ(Endo Ⅳ)以及无嘌呤/无嘧啶内切酶1(APE1)被选作DNA修复酶的模型。本论文主要分为四章：第一章为绪论部分,主要概述了DNA修复酶的概念、分类、功能、研究意义以及现有的检测方法。此外,本部分还总结了现阶段DNA修复酶活性检测领域中存在的主要问题。第二章,构建了一种基于免标记DNA机器的荧光信号扩增方法用于灵敏检测UDG的活性。在本方法中,我们设计了一个含有尿嘧啶(U)碱基和引物序列的双链DNA探针,它作为DNA机器的引发部分能进行UDG的识别和信号的转导。另外,我们还设计了两个部分互补的发夹探针,它们作为DNA机器的运行部分能用于信号的扩增。在UDG的作用下,双链DNA探针中的U碱基被移除,产生无嘌呤/无嘧啶(AP)位点,导致双链结构不稳定而发生解离,释放出引物序列。随后,该引物序列能引发DNA机器的运行,产生大量的G-四倍体(G4)结构。最后,G4结构能与N-甲基-卟啉Ⅸ(NMM)发生特异性地结合,生成G4-NMM复合物,并产生增强的荧光信号。本方法能检测低至0.00044 U/mL的UDG活性。本方法也能用于检测人宫颈癌(HeLa)细胞裂解液中的UDG活性。另外,本方法也能成功检测抑制剂对UDG活性的抑制。第三章,构建了一种基于粘性末端介导链置换的荧光信号扩增方法,它能对少量U碱基的移除产生响应,进而实现对UDG活性的灵敏检测。在本方法中,我们设计了一个单链DNA识别探针,它含有引物序列和两个U碱基。另外,我们还设计了一个含有粘性末端的发夹探针,以及一个信号报道探针。在UDG的作用下,单链DNA探针中的两个U碱基被移出,产生AP位点。该含有AP位点的单链DNA探针将不能与含粘性末端的发夹探针发生粘性末端介导的链置换反应(TSDR),从而使单链DNA探针中的引物序列仍能自由存在。随后,该引物序列与信号报道探针发生杂交,进而引发聚合切刻等温扩增反应,实现了对少量U碱基移除的灵敏响应,提高了检测UDG活性的灵敏度。然而,当UDG不存在时,单链DNA探针能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR,导致引物序列被封闭,从而不能引发后续的等温扩增反应,降低了阴性信号。本方法能检测低至0.000027 U/mL的UDG活性。第四章,构建了一种双识别发夹探针介导的荧光信号扩增方法用于灵敏且选择性地检测UDG和Endo Ⅳ的活性。当检测UDG的活性时,探针中的U碱基被目标酶移除,产生AP位点,实现了对UDG的识别。接着,AP位点被工具酶Endo Ⅳ切刻,从而使探针释放出引物序列以引发滚环扩增(RCA)反应。最后,RCA反应产生大量重复的G4序列以进行荧光信号的输出。另外,当检测Endo Ⅳ的活性时,探针中的U碱基首先被工具酶UDG转换成AP位点。接着,AP位点被目标酶切刻,实现了对Endo Ⅳ的识别。最后,结合RCA的信号扩增能力,实现对Endo Ⅳ活性的灵敏检测。本方法对UDG和Endo Ⅳ活性的检测限分别为0.00017 U/mL和0.11 U/mL。并且,本方法能将UDG和Endo Ⅳ与相应的类似物很好地区分开来。另外,本方法也实现了对APE1活性的检测。第五章,利用连接酶反应,构建了一种荧光信号扩增方法用于检测UDG的活性。当UDG存在时,识别探针中的两个U碱基被移除而产生AP位点,形成错配切口。基于DNA连接酶能够连接两侧碱基对完全匹配的切口而不能连接3’侧含错配的切口的性质,形成的上述错配切口将不能被DNA连接酶连接,探针的发夹结构保持完整,进而引发随后的信号扩增及产生过程,实现了对少量U碱基移除的灵敏响应,有助于提高UDG活性的检测灵敏度。第六章为结论部分,主要总结了本论文的创新点。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;TP212
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本文编号：1328341