基于石墨烯类纳米材料和多肽自组装的生物传感新方法研究

发布时间：2018-02-13 23:55

本文关键词： 生物传感器纳米材料石墨相氮化碳氧化石墨烯非标记酶活性比率荧光检测荧光活化成像多肽自组装　出处：《湖南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来,纳米材料由于其优异的物理化学性能,已成为当前研究的热点,纳米材料的应用更是为生物传感器的快速发展提供了新的活力。由纳米技术与生物传感器结合所组成的纳米生物传感器,涉及到化学、生物及纳米科学等多个交叉学科的应用,在生物传感器的基础理论研究中提供了许多创新性的思路。纳米生物传感器可以开发出新型检测原理和传感机制,大大提升了生物传感器的检测速度和分析性能,在临床检测、医学诊断、环境监测等领域有着越来越重要的影响。本论文以生物功能重要的重大疾病相关的标志物(如蛋白质、酶、糖等)为研究对象,结合新兴二维纳米材料(氧化石墨烯和石墨相氮化碳),发展了一系列简单、快速、高灵敏度和高选择性的新型纳米生物传感方法。此外,针对当前生物成像探针生物相容性差,容易出现假阳性信号等问题,利用多肽自组装技术,开发了新颖的多肽自组装纳米粒子用于活细胞的高灵敏、高选择性检测。研究论文的主要内容概括如下:为了进一步拓宽荧光二维纳米材料-石墨相氮化碳(g-C_3N_4)纳米片在非金属离子光学生物传感领域的应用,在第2章中,我们发展了一种新的基于g-C_3N_4纳米片的传感器用于一步、非标记、高灵敏检测酪氨酸酶(TYR)活性及其抑制剂筛选。由于g-C_3N_4纳米片的高比表面积和大π系统,基于酪氨酸酶可以高效催化酪氨酸生成各类的黑色素类聚合物,黑色素类寡聚体易于组装在g-C_3N_4纳米片表面,并原位逐渐生长成黑色素类聚合物最终猝灭g-C_3N_4纳米片的荧光。该传感策略对酪氨酸酶活性分析具有高的灵敏度和选择性,并能够用于快速的酪氨酸酶抑制剂筛选。因此,该方法建立了一个新的传感平台用于包括黑色素瘤在内的酪氨酸酶类相关疾病的早期诊断及其抑制剂筛选。过氧化氢(H_2O_2)和葡萄糖是细胞内重要生理因子之一,细胞内的H_2O_2的紊乱或累积可导致多种严重疾病如中枢神经系统疾病或癌症的产生,而血液中葡萄糖水平的高低与血糖症密切相关,因此,H_2O_2和葡萄糖的检测在研究生理和病理过程中具有重要作用。在第3章中,我们首次建立了一种基于g-C_3N_4纳米片的比率型荧光探针用于H_2O_2和葡萄糖的高灵敏检测。在辣根过氧化物酶(HRP)催化作用下,邻苯二胺(OPD)被H_2O_2氧化为其相应的氧化产物(OX~(OPD)),由于g-C_3N_4纳米片的高比表面积和大π系统,生成的OXOPD通过氢键和π-π堆积作用力组装于g-C_3N_4纳米片表面,通过光诱导电子转移(PET)猝灭g-C_3N_4纳米片的荧光的同时,伴随发出一个新的荧光峰。通过测量其比率荧光信号可以高灵敏的检测H_2O_2。由于葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下可特异性生成H_2O_2,该方法可进一步应用于葡萄糖的检测。本章发展的分析方法对H_2O_2和葡萄糖的检测下限分别为50 n M和0.4μM,并且都具有良好的选择性,该传感策略提供了一种涉及生成H_2O_2的反应物种的高通量的检测平台。为了进一步拓宽g-C_3N_4纳米片在生物成像方面的应用,在第4章中,我们利用g-C_3N_4纳米片优越的负载能力,构建了一个肿瘤靶向性的纳米组装体用于透明质酸酶(HAase)的检测,并用于活细胞内透明质酸酶激活的双光子成像分析。使用透明质酸(HA)为模版一步还原合成HA包裹的纳米金(HA-Au NPs),所合成的HA-Au NPs通过静电吸附和疏水作用力组装在g-C_3N_4纳米片表面形成多功能纳米组装体。由于HA-Au NPs和g-C_3N_4纳米片之间发生有效的荧光能量共振转移(FRET),使得g-C_3N_4纳米片的荧光被猝灭。多功能纳米组装体在HA受体(CD44)的作用下特异性进入肿瘤细胞,细胞内高表达的HAase特异性地水解固定在g-C_3N_4纳米片表面的HA-Au NPs,使得Au NPs从g-C_3N_4纳米片表面脱落,纳米组装体解离,从而产生激活的双光子成像信号。过氧化氢(H_2O_2),一种重要的生化分子,在调节各种生理过程中起着非常关键的作用。在第5章中,我们在氧化石墨烯(GO)表面在荧光标记DNA的引导下直接合成AgNPs得到纳米复合物(AgNPs-DNA@GO),在纳米复合物中,由于GO和AgNPs的双重猝灭效应,使得DNA荧光大大减弱。当加入H_2O_2时,H_2O_2与AgNPs相互作用产生羟基自由基(?OH),能有效腐蚀AgNPs并裂解DNA,从而导致纳米复合物的解离,最终荧光恢复。通过该方法可以高灵敏的检测H_2O_2并进一步应用于葡萄糖的检测。癌症,是当今严重威胁人类健康的主要疾病之一,早期诊断并及时治疗是治疗癌症的关键。高灵敏的癌细胞成像对于癌症的早期诊断具有非常重要的意义。在第6章中,我们通过设计多肽序列使其自发组装成多肽纳米粒子用于特异性的癌细胞高灵敏成像。本研究中,我们设计了一组两亲性弹性蛋白肽,其疏水区含有对组织蛋白酶B(Cat B)特异性响应并荧光供受体对标记的多肽序列以及对pH敏感的富含组氨酸的多肽序列;其亲水区含有特异性响应基质金属蛋白酶2(MMP 2)的多肽序列,在生理条件下,两亲性弹性蛋白肽组装成纳米粒子,在癌细胞中,癌细胞高表达的MMP 2特异性响应活化细胞穿膜肽介异多肽纳米粒子进入细胞,由于癌细胞内低的pH值,使pH敏感的多肽纳米粒子解组装,同时,癌细胞内溶酶体内高表达的Cat B切割其特异性序列,从而激活荧光成像。本研究所建立的多肽纳米粒子利用癌细胞生理环境,通过逐级激活纳米粒子,实现了对癌细胞高灵敏高特异性成像。
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【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1;TP212.3

【参考文献】