基于核酸放大技术和纳米材料的生物传感新方法的研究

发布时间：2018-07-06 09:16

本文选题：生物传感器 + 表面增强拉曼散射　；参考：《湖南大学》2016年博士论文

【摘要】：生物传感技术因其高灵敏度、高选择性、快速的响应速度和较低的检测成本等优点,近年来广受关注,生物传感新技术的研究进展,极大的推动了生物医学和分析化学的发展,在临床检测、医学诊断和药物筛选中具有广阔的应用前景。此外,纳米材料的发展对包括催化学、信息技术、光子学、能量学、生物学和医学众多领域产生了重大影响,引起人们对纳米技术的浓厚兴趣。纳米技术在生物学的应用尤其展现了巨大的潜力。通过使用基于纳米材料的工具用于研究、诊断和治疗技术,纳米生物技术有望带给生物学和生物医学革命性的发展。近年来,科学家们在发展多种多样的纳米材料和纳米制造技术方面取得了巨大进步,大大促进了纳米生物技术的发展。功能化的纳米材料以其独特的光学、电学和机械特性,为研究复杂的生物学过程提供了创新性的思路,解决了很多用传统方法难以实现的问题。纳米材料与生物传感器的结合,极大地推动了纳米科学、生命科学和生物医学等领域的快速发展。本论文结合功能核酸分子探针和纳米材料的优势,建立了一些生物传感新方法用于霍乱毒素、microRNA表达水平、次氯酸盐和温度、小分子的分析与测定,并实现了对癌症的诊疗和成像。具体内容如下:霍乱是因摄入的食物或水受到霍乱弧菌污染而引起的一种急性腹泻性传染病,具有全球威胁性,尤其是在那些缺乏安全的饮用水供给和卫生系统不完善的国家和地区。临床表明,霍乱主要是由霍乱弧菌分泌的霍乱毒素(CT)引起的,因此,霍乱毒素的早期检测对于预防由霍乱引起的死亡和爆发是至关重要的。第2章中,我们设计了一种新颖的等离子体耦合增强拉曼散射法-PCERS,用于高灵敏的、单步、均相检测霍乱毒素。该方法是基于我们设计的等离子体纳米粒子,该纳米粒子被磷脂双分子层包裹,并嵌入了拉曼染料和霍乱毒素的结合配体单唾液酸神经节苷脂(GM1)。该方法无需任何特别修饰或者化学组装,只需两步简单组装即实现了简单合成等离子纳米粒子。在纳米等离子体表面嵌入GM1使得该纳米粒子具有高亲和性、高特异性和多个CT结合位点。独特的磷脂双分子层修饰使得该纳米粒子具有良好的生物相容性和稳定性。由于纳米粒子与CT一步反应后组装成三明治状的团聚体,纳米粒子显示出显著增强的表面增强拉曼散射(SERS)信号。实验结果表明,该方法提供了一种简单、灵敏的CT检测新方法,并且信倍比高、可重现性好、动态响应范围广。因此该方法在预防和诊断霍乱中具有巨大的应用潜力。MicroRNA是一类内源性表达的约19-25个碱基的非蛋白编码的RNA分子,它在生物过程中起着重要的调节作用。大量的实验已经表明许多疾病,例如癌症、糖尿病以及神经系统疾病与微MicroRNA的表达水平是直接相关的。MicroRNA已成为一类新兴的临床诊断与治疗的生物标志物。然而,由于miRNA序列短、同一家族成员之间同源性强、在总RNA样品中的含量较低且容易降解,这些性质都增加了miRNA的检测难度。因此,发展灵敏度高选择性好的miRNA检测方法用于生物研究和临床早期诊断具有非常重要的意义。第3章中,利用目标催化发夹组装(CHA)放大方法和酶修复扩增技术(ERA),发展了一种新型的等温双重放大方法—(CHA-ERA),用于单步、高灵敏、高选择性的miRNA分析检测。该方法检测miRNA时,动态响应范围宽、检测限低,检测下限达到了50 f M。实验结果表明,本章构建的CHA-ERA方法为有效的核酸扩增和miRNA的表达分析及相关的诊断应用提供了一个高效的分析检测平台。活性氧簇(ROS)在生理学和病理学过程中普遍存在并且起着重要作用。ROS是一种重要的信号分子,产自内源性的氧气,在很多生理学功能的调节中起着重要的作用。?OH,ClO~-,and ONOO-被认为是最重要的活性氧簇,被称作h ROS。研究表明,h ROS的过多富集会引起氧化应激并且与很多疾病相关。因此发展一种探针用于可视化的研究h ROS的生物学作用具有重要作用。此外,反常的温度与很多病理细胞功能障碍密切相关。因此,发展一种新颖的方法用于高效、精确的检测h ROS和温度尤为重要。第4章中,我们发展了一种基于二氧化硅量子点的双重响应的比率型荧光传感器,用于检测ClO~-和温度。该方法的构建是通过将罗丹明B交联到二氧化硅表面。二氧化硅量子点的荧光可选择性的被ClO~-猝灭,而罗丹明B的荧光对ClO~-无响应,因此可用于比率型检测ClO~-。另外,二氧化硅量子点荧光强度对温度不敏感,罗丹明B的荧光强度随温度的升高会下降,因此该探针还可作为比率型的温度传感器。本章发展的纳米探针易于合成、成本低、水溶性强、毒性低,并且对ClO~-和温度检测具有高选择性。而且该纳米探针还可以通过生物成像来实现活细胞中内源性ClO~-表达水平检测。实验结果证明,该纳米探针提供了简单、灵敏和稳定的生物传感平台,为生物医学和环境检测提供一种新思路。ATP是生物体中一种重要的底物。作为细胞中的主要能量货币,ATP在细胞新陈代谢和生化途径中发挥着至关重要的作用,已经作为细胞活性和细胞损伤的指示剂。因此ATP的检测在生化研究和临床诊断中具有重要作用。第5章中,基于劈开的核酸适配体和临近介导的杂交链放大反应,发展了一种高灵敏的、高特异性的无酶放大方法用于检测ATP。两段劈开的核酸适配体在目标物ATP存在时距离被拉近。在这两段核酸适配体末端分别延伸一段DNA序列,当距离被拉近时,两端序列由于临近作用,可作为HCR反应的引发连,从而激活分子信标的荧光信号。我们合成了表面氨基功能化的正电荷的荧光聚合物纳米粒子,可与带负电的DNA探针序列通过静电吸附组装,从而将ATP探针输送到细胞内,实现细胞内ATP的实时监测。该方法有望应用于其他生物领域,如DNA和蛋白的检测,药物和基因的输送,细胞内的示踪和活体监控。目前,癌症仍然是最致命的疾病之一,带来巨大的社会和经济压力。单模式的癌症治疗不足以治疗癌症,因此发展综合治疗对攻克癌症至关重要。第6章中,发展了一种基于核酸功能化的氧化石墨烯(GO)的诊疗系统用于癌细胞靶向的生物成像和多重治疗。纳米体系是以PEG化的GO作为载体,在其上面修饰了用于癌细胞打靶的核酸适配体和用于诊疗的PH敏感的核酸探针。癌细胞中的酸性环境使核酸探针从纳米体系中脱离,激活探针上的荧光,同时释放镶嵌在DNA双链中的抗癌药物DOX,释放的探针还可作为甲基转移酶DNMT1的抑制剂,同时GO还可用于热力学治疗。因此该方法可实现多重治疗。实验结果表明该方法在细胞中均具有良好的癌症治疗效果,为成像导向的诊断和多重治疗提供了有效的策略。
[Abstract]:In recent years , the development of nano - materials has greatly promoted the development of nano - biotechnology . A novel isothermal double amplification method ( CHA - ERA ) has been developed for the diagnosis and diagnosis of diseases such as cancer , diabetes and nervous system diseases . The present invention provides a high - sensitivity , high - specificity enzyme - free amplification method for detecting ATP .
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1;TP212.3

【参考文献】