基于纳米材料和环介导等温扩增技术的电化学生物传感器的研究

发布时间：2019-04-19 13:14

【摘要】：在临床诊断、环境监测、食品分析和病原微生物研究等领域,快速、简单、灵敏的实现生物分子的检测,是目前分析化学中极具吸引力的热门研究课题之一。电化学生物传感器由于其简单、成本低、灵敏度高和易于微型化等优势在生物分子检测上得到了大力的开发和研究。关注电化学生物传感器中的新方法和新技术,利用多种特异性好的分子识别元件,结合性能优异的各种新型纳米材料,引入有效的信号放大策略,对提高电化学生物传感器的各项性能,实现对各种生物分子特异灵敏的检测具有十分重要的意义。本论文基于多种放大策略,结合功能化纳米材料和环介导等温扩增技术,在研发成本低、实用性强、操作简便的高灵敏生物传感器上做了以下工作:1.卟啉锰-DNA双链复合物引导聚苯胺原位沉积用于凝血酶的电化学检测有文献报称卟啉锰-DNA双链复合物(MnTMPyP-dsDNA)是一类优异的过氧化物模拟酶,但是到目前为止,以MnTMPyP-dsDNA为催化剂催化苯胺聚合为聚苯胺(PANI)的文献还鲜有报道。本实验提出以有过氧化物模拟酶作用的MnTMPyP-dsDNA复合物为有效的催化剂和模板,在电极表面原位催化生成PANI为电化学活性物质,构建电化学传感器用于凝血酶(TB)的灵敏检测。在构建的“夹心型”适体传感器上,高密度的MnTMPyP-dsDNA催化单元能够催化苯胺氧化形成聚苯胺,从而产生一个可测量的电化学信号。为了进一步放大电流信号,聚多巴胺和纳米金功能化的Pd@Pt合金纳米笼被用作纳米载体用于增强生物分子的固载量,为电子转移提供良好的微环境。因此,拥有免标记、良好催化性能和稳定性的MnTMPyP-dsDNA复合物,结合纳米材料显著的信号放大能力,所构建的传感器在0.5 pmol/L~30 nmol/L浓度范围内对凝血酶表现出了良好的线性响应,检测限达0.14 pmol/L。2.基于多功能的卟啉铁掺杂金属有机框架材料构建的电化学凝血酶适体传感器通过将卟啉铁(hemin)掺杂到纳米粒径的Fe-MIL-88金属有机框架材料中,合成了一种新型的多功能金属有机框架材料(hemin@MOFs),并且在酶辅助信号放大的作用下首次将其用于构建电化学凝血酶适体传感器。纳米金功能化的hemin@MOFs材料(Au/hemin@MOFs)不仅同时可作为电化学活性物质和固态的电化学催化剂,还可以被用作于理想的固载平台,固载大量的生物分子。在构建的适体传感器中,葡萄糖氧化酶(god)和凝血酶第二适体链(tbaii)固载于au/hemin@mofs纳米材料上形成第二适体耦合物(au/hemin@mofs-tbaii-god耦合物)。凝血酶夹心于au/hemin@mofs-tbaii-god耦合物和组装在电极表面的凝血酶第一适体链之间。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖转化为葡萄糖酸并伴随着h2o2的生成。在电极表面所产生的h2o2被hemin@mofs进一步催化还原,以放大hemin@mofs自身包含的hemin的电化学信号。因此,所合成的hemin@mofs集催化剂,电化学活性物质和固载平台三种不同功能于一体,可作为多功能材料的典范。通过这样的巧妙设计,该适体传感器在凝血酶浓度为0.1pmol/l~30nmol/l范围内有良好的线性响应,检测限达0.068pmol/l。3.基于β-环糊精-二茂铁主客体识别作用的多肽电化学生物传感器的研究我们通过联合二茂铁(fc)与β-环糊精(β-cd)的主客体识别作用发展了一种“信号增强型”(signal-on)的基于多肽剪切的分析方法用于灵敏特异地检测前列腺特异性抗原(psa)。首先,将一段标记了氧化还原探针二茂铁(fc)的能够被psa特异性识别剪切的多肽(fc-peptide)组装于金包四氧化三铁磁珠(fe3o4@au)表面,在目标物存在的条件下,psa能够特异性的剪切多肽,带有多肽碎片的氧化还原探针fc就会从fe3o4@au表面释放到溶液中。固载在电极表面的β-cd分子能够将释放到溶液中的fc通过主客体识别作用捕获到电极表面,从而产生电化学信号用于psa的定量检测。另外,采用碳纳米管-树枝状聚氨基胺纳米杂化材料(cnts-pamam)用于传感器敏感界面的构建,不仅能够增加β-cd的固载量用于捕获剪切释放的fc,而且还能促进fc与电极之间的电子传递。通过多肽剪切与主客体识别作用相结合,这个工作提供了一种简单的、高灵敏、高特异性的psa检测方法。该传感器线性范围为0.001~30ng/ml,检测限为0.78pg/ml。4.ph计结合环介导等温扩增技术用于家蚕微孢子虫基因dnaptp1检测的研究近年来,环介导等温扩增(lamp)是一种新兴的微生物疾病快速诊断的早期检测和识别工具。目前,lamp扩增产物的检测技术主要是基于扩增产物的凝胶电泳,焦磷酸镁的浊度,金属离子的阻抗以及电化学试剂的电化学信号,但是这些技术由于对大型昂贵实验仪器的依赖或不能实现定量检测等缺点而不被公众所广泛接受。这里,我们提出一种通过使用ph计直接测量lamp扩增过程中释放的氢离子的集放大和测定于一体的检测方法。并且首次将这种lamp-ph计策略用于家蚕微孢子虫的基因dna的检测。这种方法的核心概念是用ph计将lamp扩增过程中由于核酸聚合反应产生的氢离子引起的ph的变化,以可靠的信号输出方式记录下来,通过ph的变化值间接反映核酸的扩增程度。通过这个平台,可以检测到0.5pg/μl的家蚕微孢子虫的基因dna。此外,该方法简单、有效,将有望推广于不发达国家的农民使用。5.追踪环介导等温扩增中产生的磷酸根离子用于电化学检测家蚕微孢子虫基因DNA PTP1通常情况下,环介导等温扩增(LAMP)中扩增出的DNA检测都是基于复杂的凝胶电泳或昂贵的荧光方法。在本文中,与传统的直接检测扩增DNA的方法不同,我们通过电化学的方法间接追踪LAMP中产生的磷酸根离子(Pi)实现核酸的高灵敏检测。焦磷酸根离子(PPi)作为LAMP中核酸聚合反应的副产物,被预先加入的耐高温无机焦磷酸酶(PPase)水解成Pi。因此LAMP扩增反应中总的Pi的量是与加入的初始目标DNA模板成比例的。水解得到的Pi可以与酸性钼酸盐反应,在电极表面形成可直接作为电化学活性物质,给出易测量的电化学信号的磷钼酸沉淀。并且通过灵敏和准确的检测家蚕微孢子虫基因DNA PTP1而进一步阐述了这一方法的实用性。这个电化学方法能够定量检测目标基因DNA,其检测限达17 fg/μL。这项工作中提出的灵敏度好、特异性高以及操作简单的方法可以很容易地推广于其他类型的能够被LAMP扩增的核酸的定量分析。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TP212.3
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本文编号：2460979