应用于细胞电生理研究的自动化微米生物操作系统的开发

发布时间：2020-10-30 15:19

　　 机器人技术与自动化技术为新型药物的研发提供了很多新的方法,同时,也为生物领域的基础研究提供了新的技术与思路。目前,药物开发领域对于高精度与高效率的药物筛选与研发技术的需求与日俱增。因此,整合机器人技术以及微纳米操作技术将会对细胞层面的给药以及药物筛选效率带来进一步的提高。现有的离子通道以及相关药物研究主要集中在靶点在细胞外的药物以及悬浮细胞上。由于微米尺度的操作器和细胞的接触需要极其精密的控制,因此在微纳米的生物操作上要获得很高的成功率仍然充满着难度以及挑战。为了提高相关微米生物操作的成功率,我们应当分析针对单细胞的微操作的过程,同时,也应当开发并设计用于单贴壁细胞细胞内药物与电生理分析的新控制技术。本论文描述了可用于离子通道记录以及相关药物筛选的自动化生物微操作系统的开发方法以及技术细节,该系统可在单贴壁细胞尺度上进行相关的离子通道记录以及药物测试。该论文包括了以下三个方面研究。 首先,针对小尺寸贴壁细胞的电生理记录问题,我们设计了一个基于阻抗反馈的自动化膜片钳控制策略,并开发了用于贴壁细胞的自动化膜片钳系统。该设计理念的基本思路是利用阻抗反馈来监测整个膜片钳记录过程。通过对微电极与细胞外液的阻抗的测量,该系统可以得到细胞状态以及与微电极间的接触过程。通过与视觉识别方法结合,该系统可以对玻璃微电极与细胞进行识别并定位,同时该视觉反馈与阻抗反馈可以监测而整个膜片钳封接与测试过程。通过该方法,贴壁细胞可以避免悬浮处理带来的状态改变。相比现有的商业膜片钳系统,该膜片钳的封接状态也会得到提高并进而提高信号质量。神经母细胞瘤细胞以及大鼠背根神经节细胞上的试验证明了该方法的可行性以及效率。 然后,我们研究了一个用于细胞外液以及内液的药物递送系统,该系统可以对小尺寸细胞(直径30微米)提供精确的药物注射。细胞外液灌流系统利用一个基于聚二甲硅氧烷技术的灌流管以及微流管组成。我们设计了一个新型的电压反馈环节用来观测细胞内给药的破膜过程,分析了相关的等效电路模型和关键参数。该被测电压主要取决于细胞内药物注射过程中相关阻值的变化。通过对细胞注射过程中相关电阻的等效电路和仿真分析,我们证明了注射玻璃管尖端的电压值是一个有效的参数可以用来直接观察细胞注射过程中细胞膜的状态。我们也使用了原子力显微镜来观察不同细胞破膜时的力学反应特征,用来预测该系统用于多种细胞的应用前景。我们设计了微米尺度的单细胞注射的控制算法,使得给药系统可以快速且精确的完成药物注射。该系统用在贴壁细胞上的试验结果与模型仿真结果保持了一致,同时,该系统很好的完成了面向小尺寸贴壁细胞的细胞外药物以及细胞内药物的精确给药。 第三,应用了本自动化微米生物操作系统在研究离子通道的活动特性以及相关的电生理性质分析。我们使用了包括人工培育的细胞系以及原代细胞来测试该平台性能。同时,我们利用该系统记录并分析了与离子通道相关的药物以及化学制品(门冬氨酸,beta淀粉样蛋白,紫杉醇)。这些实验结果表示该系统和方法具备着很好的电生理研究性能。首先,实验结果表明该自动化系统与已有的手动研究方法的结果很好的保持了一致。同时,实验结果表明该系统与方法可以很好的完成需要高阻值封接的细胞贴附式记录。并且,该系统可以记录直接从大鼠提取的原代细胞,而现有的自动化膜片钳系统很难做到这一点。 总而言之,该论文中的新式的反馈控制策略以及自动微米生物操作系统提供了单贴壁细胞下细胞电生理研究的新方法。多种离子通道以及相关的药物研究证明了该系统拥有着很高的成功率以及快速的性能。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q2-33;TP242
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
List of Figures
List of Tables
Chapter 1 Introduction
    1.1 Background
    1.2 Statement of problems
    1.3 Research objectives
    1.4 Methodology and significance
    1.5 Chapter conclusion
Chapter 2 Literature review
    2.1 Ion channels disease and related drugs
        2.1.1 Ion channels
        2.1.2 Ion channel related drugs
    2.2 Ion channel drug delivery system
    2.3 Drug screening system for ion channel drugs
        2.3.1 Voltage sensitivity measurement
        2.3.2 Ion flux measurement
    2.4 Automated patch clamp system
        2.4.1 Planar patch clamp recording
        2.4.2 Pipette-based patch clamp recording
    2.5 Ion channel related disease
        2.5.1 N-Methyl-D-aspartate （NMDA） receptor and NMDA
        2.5.2 Amyloid-bets （Aβ） and Alzheimer's disease （AD）
        2.5.3 DRG cells and Taxol treatmem
    2.6 Chapter conclusions
Chapter 3 Pipette based automated patch clamp system
    3.1 Introduction
    3.2 System architecture
    3.3 Visual feedback
        3.3.1 Identification
        3.3.2 Segmentation
        3.3.3 Alignment of the visual system and the manipulation system
    3.4 Program Execution
    3.5 Critical parameter improvement
    3.6 Quantitative analysis of the automated patch clamp recording
    3.7 Experiments
        3.7.1 Cell and pipette identification
        3.7.2 Tests of ion channel blocker
    3.8 Conclusion
Chapter 4 Design of the extracellular and intracellular drug perfusionsystem
    4.1 Introduction
    4.2 Design of PDMS chamber for extracellular buffer exchange
    4.3 Equivalent circuit analysis
    4.4 Experiments
        4.4.1 Injection voltage analysis
        4.4.2 Injection of Alexa Fluor 488
        4.4.3 Study of penetration by atomic force microscope
    4.5 Conclusion
Chapter 5 Applications of the micro-biomanipulation system
    5.1 Introduction
    5.2 NMDA and NMDA receptor
    5.3 Recording of ion flux induced by amyloid-β
    5.4 Drug screening and tests of Taxol on DRG cells
    5.5 Conclusion
Chapter 6 Conclusions and Future work
    6.1 Summary
    6.2 Future work
References
致谢
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本文编号：2862655