心肌细胞阻抗和电位传感器在离子通道类海洋毒素检测中的应用研究

发布时间：2017-05-02 12:07

  本文关键词：心肌细胞阻抗和电位传感器在离子通道类海洋毒素检测中的应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着现代化工农业的快速发展,海洋生物毒素已经严重威胁到全人类的生命健康,尤其是离子通道类海洋毒素。它们占了总毒素的80%以上,是海洋生物毒素中分布最广危害最大的一类毒素,很可能会引发某些离子通道类疾病。传统的小鼠生物法为标准的毒素检测法,但因其种种局限(例如灵敏度低、重复性差等),已难以满足海洋毒素日常监测的需要。常规的基于化学结构的高效液相色谱分析法(HPLC),因其设备昂贵和技术复杂也难以完全取代小鼠生物法。近年来,一些基于功能活性的细胞检测法陆续发展起来,但传统的细胞检测手段较耗时且不能实时反映细胞的动态信息。细胞传感器作为一种新型的功能性细胞检测法,因其无损、高灵敏、实时动态检测等优势而备受国内外研究者的关注。目前,细胞传感器在海洋毒素研究中的应用还为数不多,它结合了细胞检测和生物传感器的各自优点,是一项十分有前景的毒素检测技术。本文选择稳态性和鲁棒性强的电兴奋心肌细胞作为敏感元件,旨在构建高性能心肌细胞阻抗和电位传感器,并将其应用于离子通道类海洋毒素的检测分析。本论文的主要创新性的工作在于：1.设计了高通量和多通道细胞电位传感器系统,实现了心肌细胞胞外场电位的高通量和多通道检测本文设计了两种细胞电位传感器芯片：单孔32通道微电极阵列(MEA)芯片和高通量16孔64通道MEA芯片。同时针对这两种MEA芯片开发了3种细胞电位传感器系统：单孔32通道细胞电位传感器、单孔8通道无线细胞电位传感器、高通量细胞电位传感器。最后通过心肌细胞胞外场电位实验,验证了三者均具备良好的胞外场电位检测功能。两种单孔多通道细胞电位传感器实现了细胞网络胞外场电位(EFP)的多位点检测。相比于单孔32通道细胞电位传感器,8通道无线细胞电位传感器在外型上实现了便携式小型化,更方便于EFP检测。高通量细胞电位传感器在单孔细胞电位传感器的基础上实现了多个细胞样本EFP的同步检测,大大提高了检测效率。2.深入研究了促进心肌细胞与传感器芯片耦合的改进方法,并成功构建了高度稳定性和一致性的心肌细胞阻抗和电位传感器本文深入研究了芯片表面蛋白修饰法和优化细胞培养密度法对心肌细胞和传感器芯片耦合的促进作用。研究结果表明,对于细胞阻抗传感器(ECIS)芯片而言,心肌细胞按优化密度12k/well(8.5万/cm2)培养在经高分子蛋白明胶修饰的96孔ECIS培养板上,可促使心肌细胞和ECIS芯片形成高度紧密的耦合。在此条件下构建的高通量心肌细胞阻抗传感器,能稳定输出一致性良好的搏动信号(搏动幅值：0.045-0.05；搏动频率：90-105次/min),信号稳定期(毒素干预的最佳时期)可以维持32h；对于MEA芯片而言,研究结果表明了心肌细胞按优化密度12万/cm2培养在经明胶修饰的单孔MEA芯片上,可促使心肌细胞和MEA芯片形成高度紧密的耦合。在此条件下构建的单孔8通道无线心肌细胞电位传感器,能稳定输出一致性良好的胞外场电位(EFP)信号(峰电位幅值：16-1.8 mv；发放频率：150-180次/min),信号稳定期可以维持60 h。本文同时选了两种典型的工具药物异丙肾上腺素和利多卡因对优化后的两种高性能心肌细胞传感器进行了分析性能的测试,实验结果表明了心肌细胞阻抗和电位传感器均对测试药物做出了正确而灵敏的响应,具备良好的检测分析功能。3.提出了高通量检测石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)的心肌细胞阻抗传感器检测方法本文将优化后的高通量心肌细胞阻抗传感器应用于离子通道类海洋毒素的毒性评价,提出了一种新型高通量的离子通道类海洋毒素功能性检测法。我们主要研究了3种具有代表性的离子通道类海洋毒素(STX、TTX、PbTx-2)的毒性作用。通过分析毒素作用24 h后心肌细胞阻抗传感器的信号特征参数(细胞指数CI、搏动幅值BA、搏动频率BR)的变化,得出该阻抗传感器对PbTx-2的敏感性较差,对高浓度(4μM,3.6 ppm)的PbTx-2没有响应；对STX的敏感参数为BR,检出限为0.09 ng/mL,检测范围为0.25～20 nM和0.18-14.6μM；对TTX的敏感参数为BR,检出限为89 ng/mL,检测范围为0.4～20μM。该阻抗传感器实现了STX高通量高灵敏检测。心肌细胞电位传感器法具有通量高、检出限低、重复性好等优点,有望成为新型高通量的离子通道类海洋毒素检测平台。4.提出了快速检测石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)和短裸甲藻毒素(PbTx-2)的心肌细胞电位传感器检测法基于心肌细胞阻抗传感器检测法的研究基础,本文将优化后的单孔8通道无线心肌细胞电位传感器应用于离子通道类海洋毒素的毒性评价,提出了一种新型快速的离子通道类海洋毒素功能性检测法。我们同样选择STX、TTX、 PbTx-2作为研究对象,通过分析毒素作用5 min后心肌细胞电位传感器EFP信号特征参数(峰电位幅值SA、发放频率FR、峰电位半时程SPD50)的变化,得出该电位传感器对STX和PbTx-2的敏感参数分别为FR和SPDso,检出限分别为0.35 ng/mL和1.55 ng/mL检测范围均为1.56～400 nM；对TTX的敏感参数为FR,检出限分别为83 ng/mL,检测范围为400～3200 nM。该电位传感器实现了STX和PbTx-2的快速高灵敏检测。心肌细胞电位传感器法具有简便快速、检出限低、重复性好等优点,有望成为新型快速的离子通道类海洋毒素检测平台。
【关键词】：心肌细胞阻抗传感器 心肌细胞电位传感器 石房蛤毒素(STX) 河豚毒素(TTX) 短裸甲藻毒素(PbTx-2) 细胞阻抗信号 胞外场电位信号
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TP212;R99
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-16
• 第一章 绪论16-32
• 1.1 海洋生物毒素概述16-17
• 1.2 离子通道类海洋毒素17-23
• 1.2.1 离子通道类海洋毒素简介17
• 1.2.2 离子通道类海洋毒素的种类17-21
• 1.2.3 离子通道类海洋毒素的作用机制21-23
• 1.3 离子通道类海洋毒素的现有检测方法23-27
• 1.3.1 传统小鼠生物法24
• 1.3.2 基于化学结构的检测法24-26
• 1.3.3 基于功能活性的检测法26-27
• 1.4 细胞传感器在离子通道类海洋毒素检测中的应用27-29
• 1.5 论文的主要研究内容29-32
• 第二章 心肌细胞阻抗和电位传感器理论基础32-48
• 2.1 细胞传感器原理32-33
• 2.2 细胞敏感元件的选择33-37
• 2.2.1 神经元和心肌细胞对毒素敏感性的比较33-34
• 2.2.2 细胞阻抗传感器敏感元件的选择34
• 2.2.3 细胞电位传感器敏感元件的选择34-37
• 2.3 心肌细胞的生理特性37-41
• 2.3.1 心肌细胞的基本结构37-38
• 2.3.2 心肌细胞的动作电位及其形成机制38-39
• 2.3.3 心肌细胞的兴奋-收缩偶联机制39-41
• 2.4 心肌细胞阻抗传感器机理41-44
• 2.4.1 细胞阻抗传感器基本模型41-42
• 2.4.2 心肌细胞生长和搏动检测原理42-44
• 2.5 心肌细胞电位传感器机理44-47
• 2.5.1 心肌细胞动作电位H-H模型44-45
• 2.5.2 心肌细胞电位传感器模型45-47
• 2.5.3 心肌细胞胞外场电位检测原理47
• 2.6 本章小结47-48
• 第三章 高通量和多通道细胞电位传感器系统的设计48-66
• 3.1 细胞电位传感器的研究背景48-49
• 3.2 细胞电位传感器芯片的设计49-56
• 3.2.1 单孔32通道MEA芯片的设计与加工49-54
• 3.2.2 高通量MEA芯片的设计与加工54-55
• 3.2.3 传感器芯片的清洗与保存55-56
• 3.3 细胞电位传感器系统设计56-65
• 3.3.1 单孔32通道细胞电位传感器系统56-57
• 3.3.2 单孔8通道无线细胞电位传感器系统57-58
• 3.3.3 高通量细胞电位传感器系统58-59
• 3.3.4 细胞电位传感器系统基本性能测试59-60
• 3.3.5 心肌细胞胞外场电位检测60-65
• 3.4 本章小结65-66
• 第四章 心肌细胞阻抗和电位传感器的性能优化及其分析性能测试66-94
• 4.1 引言66-70
• 4.2 实验方法70-72
• 4.2.1 试剂与耗材70
• 4.2.2 心肌细胞原代培养70-71
• 4.2.3 传感器芯片蛋白修饰实验71
• 4.2.4 心肌细胞密度实验71-72
• 4.2.5 心肌细胞传感器药物测试实验72
• 4.3 心肌细胞阻抗传感器的性能优化72-81
• 4.3.1 心肌细胞阻抗传感器的构建72-74
• 4.3.2 蛋白修饰对心肌细胞和ECIS芯片耦合的影响74-75
• 4.3.3 细胞密度对心肌细胞和阻抗芯片耦合的影响75-78
• 4.3.4 心肌细胞阻抗传感器的药物测试78-81
• 4.4 心肌细胞电位传感器的性能优化81-92
• 4.4.1 心肌细胞电位传感器的构建81
• 4.4.2 蛋白修饰对心肌细胞和MEA芯片耦合的影响81-83
• 4.4.3 细胞密度对心肌细胞和MEA芯片耦合的影响83-86
• 4.4.4 EFP信号模式分析86-89
• 4.4.5 心肌细胞细胞电位传感器的药物测试89-92
• 4.5 本章小结92-94
• 第五章 心肌细胞阻抗传感器应用于离子通道类海洋毒素的分析94-110
• 5.1 引言94-95
• 5.2 心肌细胞阻抗传感器检测方法95-97
• 5.2.1 毒素检测原理95
• 5.2.2 毒素样品准备95-96
• 5.2.3 毒素检测流程96-97
• 5.2.4 数据分析97
• 5.3 离子通道类海洋毒素的毒性评价97-108
• 5.3.1 石房蛤毒素(STX)检测分析97-100
• 5.3.2 河豚毒素(TTX)检测分析100-103
• 5.3.3 短裸甲藻毒素(PbTx-2)检测分析103-105
• 5.3.4 贝肉实际样品的检测105-106
• 5.3.5 结果讨论与分析106-108
• 5.4 本章小结108-110
• 第六章 心肌细胞电位传感器应用于离子通道类海洋毒素的分析110-130
• 6.1 引言110-111
• 6.2 心肌细胞电位传感器检测方法111-113
• 6.2.1 毒素检测原理111
• 6.2.2 毒素样品准备111-112
• 6.2.3 毒素检测流程112
• 6.2.4 数据分析112-113
• 6.3 离子通道类海洋毒素的毒性评价113-124
• 6.3.1 石房蛤毒素(STX)的检测分析113-116
• 6.3.2 河豚毒素(TTX)检测分析116-118
• 6.3.3 短裸甲藻毒素(PbTx-2)检测分析118-121
• 6.3.4 贝肉实际样品检测121-122
• 6.3.5 结果讨论与分析122-124
• 6.4 心肌细胞电位传感器法与其他生物检测法的比较124-128
• 6.4.1 小鼠生物法检测STX毒素124-125
• 6.4.2 荧光成像法检测STX毒素125-128
• 6.4.3 结果讨论与分析128
• 6.5 本章小结128-130
• 第七章 总结与展望130-134
• 7.1 全文总结130-132
• 7.2 工作展望132-134
• 参考文献134-146
• 作者简历146-148
• 攻读学位期间发表的学术论文及成果148-150
• 致谢150

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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1 肖丽丹;微电极阵列细胞芯片的设计及其对心肌细胞生理特性的研究[D];浙江大学;2011年

  本文关键词：心肌细胞阻抗和电位传感器在离子通道类海洋毒素检测中的应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：340911