四面体DNA纳米结构探针设计及其在生物传感中的应用

发布时间：2017-08-24 00:01

  本文关键词：四面体DNA纳米结构探针设计及其在生物传感中的应用

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【摘要】：本论文主要是设计四面体DNA纳米结构探针，并将其应用于生物传感。生物分子检测的灵敏度不仅由分子之间的亲和力决定，还与生物传感器的界面性质相关。在宏观界面，探针数量多，探针之间相互缠绕，而且传质慢；在微-纳米界面，探针传质速度快，但是界面有限，限制了有效的探针数目。而将四面体DNA纳米结构组装在宏观电极表面不仅具有探针数量多，而且能精确控制探针之间的距离，具有纳米探针传质速率快的优势，提高检测灵敏度。此外，四面体DNA纳米结构具有一定的厚度，可以提供类溶液环境，提高捕获探针和靶分子结合能力。因此，本论文基于四面体DNA纳米结构，首先实现跨尺度界面精确调控用于超灵敏DNA检测、发展microRNA检测的电化学传感器、亚甲基蓝电子传递研究和循环肿瘤细胞捕获，具体如下： 第一，构筑有序、可控的生物传感界面是生物检测研究领域的挑战性问题之一。针对这一问题，我们利用DNA纳米结构精确可控特点，设计一系列不同尺寸的DNA四面体纳米结构，并利用这些结构在金界面的有序组装发展一种“软光刻”技术。这种跨尺度精确调控技术可以实现在宏观的金界面上构筑纳米尺度可控的框架结构，精确调控依托于这些结构上的DNA探针之间的距离。同时，系统地研究DNA分子之间的纳米距离与生物传感性能之间的关系，，并提高界面生物分子识别的热力学和动力学过程，从而显著性提高电化学生物传感器的检测灵敏度和速度。 第二，发展了基于靶标响应、四面体DNA纳米结构的E-DNA传感器用于microRNA检测。microRNA调控许多细胞内过程，成为重要的肿瘤标志物之一，但是microRNA序列短、含量低，难以发展快速、廉价、简单的检测方法。四面体DNA纳米结构很好控制茎环结构的密度，提高反应活性，能够特异性检测低至1fM的microRNA-141。 第三，联合四面体DNA纳米结构探针和杂交链式反应（HCR）放大，实现超灵敏的microRNA检测，可以分别检测100aM、10aM的DNA和microRNA，灵敏度比超级夹心法至少提高3个数量级，比第三代E-DNA传感器提高100倍。 第四，四面体构型的稳定性和刚性保证了探针的取向、探针间的距离，避免探针互相缠绕，可以精确研究亚甲基蓝（MB）在不同位置的电子传递。首次提出MB在nick处不嵌入双链π-堆积的碱基对中而阻碍了MB的电子传递，具有应用于分子开关的潜能。利用MB分子在两种碱基环境中信号差异，设计茎环结构的基因传感器，对靶序列有正响应，即signal-on传感器，可以避免假阳性产生。并且这种传感器只要一步合成，简单、方便，能够灵敏地区分单碱基错配。 最后，利用四面体DNA纳米结构作为刚性支架，可控连接多个EpCAM的aptamer SYL3C，用于增强捕获循环肿瘤细胞（CTCs）。通过改变四面体DNA纳米结构的大小，控制aptamer之间的距离；通过控制四面体延伸链的方向和个数，可以控制aptamer的取向和价数。组装在四面体纳米结构上的aptamer保持特异性结合CTCs的特点，并且三价aptamer纳米结构比单价aptamer结合细胞有更强的亲和力，和更高的捕获效率。这种基于DNA纳米结构捕获细胞的方法，具有生物兼容性，对细胞损伤小，分离后的细胞存活率超过85%，保持细胞膜完整，可直接用于细胞培养，并且培养的细胞具有增殖能力，保持正常水平的细胞形态、细胞蛋白表达和mRNA表达。另外，这种多价aptamer四面体DNA纳米结构可以有效分离混合体系、全血里少量的（100个及以下）MCF7，捕获效率超过70%，比单价aptamer捕获效率高20%以上，而且还可以应用于乳腺癌患者全血中CTCs的检测。
【关键词】：四面体DNA纳米结构 界面调控 microRNAs 电子传递 循环肿瘤 细胞捕获
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（上海应用物理研究所）
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O657.1;TP212
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 目录10-13
• 第一章 绪论13-37
• 1.1 一维 DNA 纳米线在生物传感中的应用15-19
• 1.1.1 滚环放大法15-18
• 1.1.2 杂交链式反应放大法18-19
• 1.2 二维 DNA 纳米结构在生物传感中的应用19-22
• 1.2.1 基于 DNA tile 结构的分子检测19-20
• 1.2.2 基于 DNA origami 的分子检测20-22
• 1.3 三维 DNA 纳米结构在生物传感中的应用22-25
• 1.3.1 基于 DNA 水凝胶的分子检测22-23
• 1.3.2 基于四面体 DNA 纳米结构的分子检测23-25
• 1.4 本课题的设计25-29
• 参考文献29-37
• 第二章 利用 DNA 纳米结构构筑有序、可控生物传感界面用于超灵敏 DNA 检测37-75
• 2.1 引言37-38
• 2.2 实验部分38-46
• 2.2.1 实验试剂与仪器38-42
• 2.2.2 实验步骤42-46
• 2.3 结果与讨论46-68
• 2.3.1 四面体 DNA 纳米结构形成表征46-50
• 2.3.2 四面体 DNA 纳米结构在电极表面的组装、密度测定50-58
• 2.3.3 四面体 DNA 纳米结构在电极表面杂交动力学和杂交效率的研究58-60
• 2.3.4 四面体 DNA 纳米结构调控 DNA 生物传感器60-68
• 2.4 结论68-70
• 参考文献70-75
• 第三章 构建基于目标响应、四面体 DNA 纳米结构的 E-DNA 传感器用于 microRNA检测75-91
• 3.1 引言75-77
• 3.2 实验部分77-80
• 3.2.1 实验试剂与仪器77-79
• 3.2.2 实验步骤79-80
• 3.3 结果与讨论80-86
• 3.3.1 第三代 E-DNA 传感器检测 microRNA 的电化学表征80-81
• 3.3.2 反应温度的优化81-82
• 3.3.3 茎环结构中茎长度的优化82-84
• 3.3.4 第三代 E-DNA 传感器用于 microRNA141 的灵敏性和特异性测定84-85
• 3.3.5 第三代 E-DNA 传感器检测 microRNA 通用性验证85-86
• 3.4 结论86-87
• 参考文献87-91
• 第四章 联合四面体 DNA 纳米结构和杂交链式反应实现超灵敏 MicroRNA 检测91-113
• 4.1 引言91-94
• 4.2 实验部分94-99
• 4.2.1 实验试剂与仪器94-96
• 4.2.2 实验步骤96-99
• 4.3 结果与讨论99-106
• 4.3.1 四面体 DNA 纳米结构形成表征99-100
• 4.3.2 溶液中杂交链式反应的验证以及与超级夹心结构的比较100-102
• 4.3.3 QCM 验证金表面上 HCR 反应的发生102-103
• 4.3.4 联合四面体 DNA 纳米探针和 HCR 构建 DNA 电化学传感器103-104
• 4.3.5 联合四面体 DNA 纳米探针和 HCR 构建 microRNA 电化学传感器104-106
• 4.4 结论106-107
• 参考文献107-113
• 第五章 基于四面体 DNA 纳米结构的亚甲基蓝电子传递的研究113-137
• 5.1 引言113-115
• 5.2 实验部115-119
• 5.2.1 实验试剂与仪器115-117
• 5.2.2 实验步骤117-119
• 5.3 结果与讨论119-132
• 5.3.1 MB 在双链两端的电子传递研究119-121
• 5.3.2 MB 在四面体 DNA 纳米结构顶端延伸双链两端的电子传递研究121-123
• 5.3.3 基于 MB 分子在四面体 DNA 纳米结构顶端双链位置不同信号差异设计电化学传感器用于单碱基错配分析123-126
• 5.3.4 计算 MB 分子在不同茎环结构以及加了完全互补序列、单碱基错配序列的电子传递速率常数126-129
• 5.3.5 研究 MB 分子电子传递机制129-131
• 5.3.6 基于 MB 在四面体顶端茎环结构对靶分子响应设计 signal-on 基因传感器131-132
• 5.4 结论132-134
• 参考文献134-137
• 第六章 四面体 DNA 纳米结构介导的可控、多价 aptamer 用于增强循环肿瘤细胞捕获137-159
• 6.1 引言137-139
• 6.2 实验部分139-144
• 6.2.1 实验试剂与仪器139-142
• 6.2.2 实验步骤142-144
• 6.3 结果与讨论144-154
• 6.3.1 多价 aptamer 四面体 DNA 纳米结构的形成及其特异性结合 CTCs144-148
• 6.3.2 不同价态 aptamer 与细胞结合能力的比较148-149
• 6.3.3 多价 aptamer 可有效捕获细胞149-150
• 6.3.4 分离后细胞存活度和 RT-PCR 分析150-152
• 6.3.5 在模拟样本和乳腺癌患者全血中的 CTCs 捕获152-154
• 6.4 结论154-155
• 参考文献155-159
• 第七章 总结与展望159-161
• 攻读博士学位期间发表论文161-163
• 致谢163-165

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 仰大勇;许传营;彭松明;崔金辉;俞雁;韩伟;崔海信;罗丹;;DNA水凝胶分子设计、合成与应用[J];科学通报;2014年02期

2 ;Electrochemical single nucleotide polymorphisms genotyping on surface immobilized three-dimensional branched DNA nanostructure[J];Science China(Chemistry);2011年08期

本文编号：728035