应用玉米RIPs基因转化马铃薯提高其抗病性研究

发布时间：2016-03-16 09:38

许多许多马铃薯育种工作将重点放在了较少的生产资料(像水、肥料、土地)来获得比目前主栽品种产量和品质更高的优良品种的培育上,同时将注意力集中于签定品种对主要病害和虫害的育种工作将重点放在了较少的生产资料(像水、肥料、土地)来获得比目前主栽品种产量和品质更高的优良品种的培育上,同时将注意力集中于签定品种对主要病害和虫害的抗性上减少农药的需求,借此保持或提高环境的安全性。长期的马铃薯常规育种显示,由于马铃薯栽培种的4体遗传特性,不仅使有效基因的积累十分困难,同时目标性状的选择准确性和效率均很低,加之长期的种内杂交育种而造成的遗传资源狭窄,人们愈来愈认识到常规育种速度已很难在短期满足市场对马铃薯品种的需求。世界范围内的马铃薯育种正经历一个快速变化的时期。近年生物技术的进展使得培育带有复合修饰性状的越来越多复杂转基因作物成为可能。马铃薯基因工程正在全球范围内开展,通过创制转基因马铃薯植株来研究目的基因的表达产质量性状的影响。植物已经进化出一个复杂的病原体防御体系,它由特定防御途径的诱导和细胞润亡之间牢固的平衡所驱动。近年,针对涉及这些防御的许多基因及其产物的鉴定与了解上取得了长足进展。这些发现推动植物先天防御体系操作、抗真菌蛋白的产生和对真菌致病因子的中和为基础来产生真菌抗性转基因植物的种种策略的发展。

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2PCAMBIA2301质粒的RIPs基因扩增及RIPs基因基因测序

2.1材料与方法

取-80冰箱内保存的农杆菌菌种,在固体板上划线,每个冻干管内的培养物接种1个固体平板。静置培养至单菌落生长至粟粒大小进行下一步操作。在Millam等的转化方案中有两点值得在今后的研究中借鉴:(1)在不同器官作为转化外植体的选择上,节间通常反应最为灵敏且对高生产率体系而言是最快的体系。(2)抗生素筛选推迟到到第二种再生培养基(相当于本研究的MSGII)上再进行(他们的方案中在共培养结束后12d才有了抗生素筛选,本研究中只有2d)。因为他们经过广泛的试验发现共培养后过早进行选择几乎没什么益处,实际上再生率会因此而降低。

2.2结果与分析

由表3可见,再生体系对照(CK-Kan)外植体全部愈伤化(见图3)并产生20%(4/20)再生芽(部分产生再生芽的愈伤组织见图4),证明该再生体系具有诱导创伤叶圆片愈伤化和诱导愈伤组织产生再生芽的能力(参看附录图a),再生体系有效;另一个对照"CK+Kan"上无愈伤组织形成,该处理在转接到含Kan的MSGII上继代则会观察到外植体失绿白化(图5左侧H角瓶),与无选择则压力的"CK-Kan"比较,证明50mg/L卡那霉素作为选择压力有效;转化处理在MSGI上愈伤化比例与对照CK-Kan相同,为100%(80/80)(见图6),转化抗性芽再生比例为6.25%(5/80)(部分产生抗性芽的愈伤组织见图7),比CK-Kan芽再生比例20%低许多。本试验进行了2批次转化,每批转化了40个外植体,外植体均100%愈伤化。其中第1批有3个愈伤组织上诱导出了抗性再生芽,从这3个愈伤组织上陆续获得39个抗性芽,在抗性芽进行离体繁殖时农杆菌污染5株弃去,成活34株,其中有记录的1个愈伤组织上生了8个抗性芽;第2批有2个愈伤组织上诱导出了抗性再生芽,参考前人的做法,本批只从每个愈伤组织上各取最早形成的1个抗性再生芽。2批次转化总计80个外植体,全部愈伤化,其中5个愈伤组织上诱导出了41个抗性再生芽,各抗性芽经单独离体繁殖成活36株。

3玉米RIPs基因对马铃薯转化.......25

3.1材料与方法.......25
3.2结果与分析.......26
3.3讨论.......27
3.4小结.......31
4RIPs基因在受体马铃薯中表达的分子检测.......31
4.1材料与仪器设备.......31
4.2试验方法.......34
4.3结果与分析.......43
4.4讨论.......50
4.5小结.......51
5转RIPs基因马铃薯抗病性鉴定.......51
5.1材料与方法.......51
5.2结果与分析.......55
5.3讨论.......60
5.4小结.......62

6结论

6.1以农杆菌介导的叶圆片转化法获得了5个卡那霉素抗性株系的36个化抗性株，建立的转化体系遗传转化率为6.25%。6.2来自3个卡那霉素抗性株系的34个株的基因組中均扩错到了基因,经Southern印迹分析证实各抗性株基因组合了2或4个拷贝RIPS基因;RT-PCR分析表明RIPS基因在转录水平正常表达,且RIPS基因在根中的表这量高于茎叶;蛋白提取物具有化RIPS产物。6. 3温室盆栽试验证实有1个转基因株系显著提高了对由马铃薯块茎的抗性;6.4离脱叶接种单生理小种悬浮液鉴定转基因株系抗性,来自同一个株系的4个株均提高疫病;9个生理小种悬浮液混合物接种离脱叶鉴定3个转RIPS基因株系,其中2个株系抗性得到显著改善。本研究在马铃薯中表达核糖体失活蛋白基因以改善受体对真菌抗性为国内首次报道。研究开辟了改善马铃薯抗病性的新途径。

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7讨论与展望

另外,所有核糖体失活蛋白都有较强免疫原性。限制了医疗上用作治疗剂及植物基因工程应用。但也有报道发现突变了的核糖体失活蛋白在保留其酶促活性的前提下免疫原性降低,这核糖体失活蛋白在植物基画工程中的应用扫清道路。再有,离体和异源表达均证明核糖体失活蛋白与几了质酶或葡聚糖酶么间有协同作用。而马铃薯恰恰有内源性的质酶和葡聚糖酶基因。因此,从协同作用考虑,核糖体失活蛋白基因在马铃薯中表达有着天然的优势,不失为提离受体马铃薯抗病性的一个有效途径。

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参考文献（略）

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本文编号：35034