蓝莓酒渣花色苷的提取及抗氧化活性研究
发布时间：2016-03-21 09:51
第一章 绪论
1.1.1 蓝莓种类
蓝莓主要分布区域在北半球的温带和亚热带，全球共有蓝莓品种约 400 余种。中国约有 100 余种蓝莓品种及其变种，分布地区集中在西南和东北一带。我国主要栽培品种有三类，即高丛蓝莓（Vac-cinium corymbosum）、矮丛蓝莓（Vaccinium chamaebuxus）和兔眼蓝莓（Vaccinium ashei）[3-4]。高丛蓝莓又可分为北高丛蓝莓、南高丛蓝莓和半高丛蓝莓，它的种植面积是目前世界人工种植面积最大的蓝莓品种，在北温带和亚热带是其商业种植的集中区域。其中北高丛蓝莓适宜种植在北方，而南高丛蓝莓适宜在南方种植，半高丛蓝莓是高丛蓝莓和矮丛蓝莓的杂交品种，也适合种植在北方。矮丛蓝莓在美国和加拿大分布广泛，适宜栽植在北方寒冷地区[5]。兔眼蓝莓的原产地位于北美洲，其生长能力强、耐 pH值幅度大、休眠期短、需水期短，极其适合在我国南方地区推广种植[6]。
1.1.2 蓝莓营养价值
蓝莓是美国农业部营养研究中心研究过的多种水果蔬菜中抗氧化活性成分含量最高的。蓝莓果肉细腻，富含维生素和多种矿物质，已在蓝莓浆果中检测到了 19 种氨基酸，其中有 8 种是人体所需要的必需氨基酸[7]。每 100g 新鲜蓝莓果中，有 400-700mg 的蛋白质、500-600mg 的脂肪、12.3-15.3g 的碳水化合物、81-100 IU 的 VA，还有大量的多酚和黄酮类物质，花色苷含量是其他植物的很多倍[8]。正因为蓝莓含有很高的营养价值，现如今各种蓝莓制品已风靡全球，成为人们日益推崇的保健食品。
1.1.3 蓝莓分布利用情况
全球的越桔属植物共有 400 余种，集中生长于北半球的亚热带等地区。我国野生蓝莓资源主要集中分布在吉林长白山和黑龙江大、小兴安岭一带，据估算我国野生蓝莓的年产量约为 100 万吨，而蓝莓加工厂年加工总量在 1000 吨以下，约为野生产量的 0.1%。
野生蓝莓采摘困难且口感不好，一直以来没有得到足够的重视，但随着蓝莓营养价值日益被人们所了解，现在野生蓝莓的产量已经变的供不应求，这使蓝莓的种植有了广阔的发展空间。现在种植蓝莓的主要地区主要有长白山、大小兴安岭，辽东、胶东半岛，长江地区和华南一带[9-11]。
......
花色苷是由花青素与糖结合而成，花青素的基本结构是 3，5，7-三羟基-2-苯基苯并毗喃，也被叫做花色基元（见图 1-1）。花色苷结构中含有 C6-C3-C6结构，花色苷的配基能够和糖结合形成配糖体。由于花青素极不稳定，多数的 3，5，7 碳位被羟基取代，其它位置上的取代基也不相同，这样花青素就分为很多种，自然界中以游离形式的花青素很少，多以花色苷的形式存在。现在已知的花青素一共有 6 种（见表 1-1）。能与花青素结合生成糖苷键的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等单糖，以及这些单糖形成的二糖或三糖，最常见的有 3-单糖苷、5-双糖苷、3，5-二糖苷和 3，7-二糖苷[32]。
花色苷的提取方法有很多，常用的有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法和酶法辅助提取法等。其中最常用的是溶剂萃取法，不同原料中的花色苷种类和含量都不相同，所以通常根据目标提取物的属性来选择何种提取方法。如果目的是为了定性、定量，那么提取方式不能破坏花色苷的结构；如果目的是为了保持色素稳定，当做食品添加剂使用，则应以提取率为指标，减少颜色的变化并保持其稳定性不变。
天然色素最常用的提取方法是溶剂提取法，溶剂提取法的关键是选择合适的提取剂。选择合适的提取剂，不仅要考虑到对目标提取物应有较大的溶解度，还要避免溶解大量杂质，还应对成本、安全性、对环境的污染和回收等因素加以考虑。有研究表明，在食品领域提取花色苷时，最好采用无毒的乙醇。由于花色苷在酸性条件下稳定，用盐酸酸化可以使提取液 pH 较低，能够提高花色苷提取率，并保持其结构稳定。徐美玲等[35]用溶剂提取法提取蓝莓果中的花色苷，提取率达到 5.8%。张学宁等[36]比较了水浴法、微波法和超声波法对蓝莓果实花色苷的最佳提取工艺，结果显示：超声波法适于北陆和乔治 2 个品种。
借助超声波技术来提取花色苷，其原理是：超声波的空化作用可以破坏植物细胞的细胞壁，使溶剂扩散速率加快，最后可经分离获取目标物质，超声波技术的优点很多，目前在中草药提取方面应用的最多[37-38]。花色苷热稳定性极差，可以用超声波辅助萃取来降低提取的温度，避免花色苷在高温时发生降解。李双石等[39]应用超声波法萃取葡萄皮渣中的花色苷，结果花色苷的提取量又显著的提高。陈钢等[40]用超声波提取黑莓果中的花色苷，结果表明，黑莓花色苷溶液还原力高于VC。
......
第二章 蓝莓酒渣花色苷提取工艺的研究
......
2.2 试验方法
2.2.1 工艺流程蓝莓酒渣→40℃烘干至恒重→粉碎过 60 目筛→提取液提取→抽滤→滤液定量测定
取一定量的蓝莓酒渣粉在不同条件下提取，提取液过滤后定容到一定体积，稀释一定倍数后，分别测量花色苷、总酚和总黄酮的吸光值，计算其提取量。
2.2.2 蓝莓酒渣基本指标测定
2.2.2.1 花色苷标准曲线的测定
（1）pH 1.0 与 pH 4.5 缓冲溶液的配制：
精确称取氯化钾 0.373mg，溶于 25mL 蒸馏水中，在加入 1.107mL 浓盐酸（体积分数37%、浓度 12.1mol/L），混匀后即为 pH 1.0 的缓冲溶液，放入冰箱备用。
精确称取 2.772g 三水合醋酸钠，溶于 20mL 蒸馏水中，在加入 0.992mL 浓盐酸（体积分数 37%、浓度 12.1mol/L），混匀后在加入 30mL 蒸馏水，混匀后即为 pH 4.5 的缓冲溶液，放入冰箱备用。
（2）标准曲线的绘制
花色苷(ACY)含量的测定采用 pH 示差法[121]，根据李安文[122]的方法进行改进。精确称取 7.2mg 矢车菊素 3-O-葡萄糖苷标准品，溶解后定容到 10mL 作为母液，分别稀释到浓度为 0.012mg/mL、0.024mg/mL、0.036mg/mL、0.048mg/mL、0.072mg/mL，分别用 pH1.0 和pH4.5 的缓冲液定容至 10mL，分别在 520nm 与 700nm 处测定溶液的吸光度，代入公式 2-1计算吸光值 A，以浓度 C 为横坐标，吸光值 A 为纵坐标绘制花色苷标准曲线。
2.2.2.2 总酚标准曲线的绘制
参照蔡义忠等[123]的 Folin-Ciocalteu 比色法进行多酚含量的测定。精确称取没食子酸标准品 10mg，用水溶解并定容到 100mL，得 0.1mg/mL 的对照品标准溶液。分别准确量取上述标准液 0、1、2、3、4、5mL 于 10mL 容量瓶中，各加 2mL 福林试剂，摇匀，4min 后，加入 7.5% Na2CO3溶液 2mL，用蒸馏水定容，充分混合后避光反应 2h，在 760nm 波长测定溶液吸光值 A，以浓度 C 为横坐标，吸光值 A 为纵坐标绘制总酚标准曲线。
2.2.2.3 总黄酮标准曲线的绘制
总黄酮采用芦丁为参比标准，用分光光度法测定[124]。准确称取芦丁标准品 10mg，用95%乙醇溶解后，配制成 0.2mg/mL 的标准贮备液，放入冰箱备用。用移液枪分别准确吸取贮备液 0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于 10mL 容量瓶中，分别加入 50%乙醇使成容量瓶中液体达到 5mL 后，加入 5% NaNO2溶液 0.3mL，6min 后加入 10%Al(NO3)3溶液 0.3mL，再过 6min 后加入 4 %NaOH 溶液 4mL，用 50%乙醇定容，摇匀后静置 l5min，在 510nm 处分别测吸光值 A，以浓度 C 为横坐标，吸光值 A 为纵坐标绘制总黄酮标准曲线。
2.2.3 溶剂法提取蓝莓酒渣中花色苷、总酚、总黄酮
将蓝莓酒渣 40℃烘干，用高速粉碎机粉碎，粉末过不同目数的筛子，称取 1g 酒渣，置于 100mL 锥形瓶中，在不同提取条件下提取后抽滤，滤液稀释一定倍数后测量花色苷、总酚、总黄酮的吸光值，根据标准曲线计算各物质的提取量。对各工艺参数进行优化后，选择对提取效率影响显著的因素设计正交实验，通过正交分析，得出最佳实验参数。
......
3.1 试验材料与仪器.......................................... 34
3.1.1 主要材料与试剂 ...................................... 34
3.1.2 试验仪器.............................................. 34
3.2 试验方法................................................. 34
3.4 结论 .................................................... 48
第四章 蓝莓酒渣花色苷稳定性研究 ...............................49
4.1 试验材料与仪器 ......................................... 49
4.1.1 主要材料与试剂 .................................... 49
4.1.2 主要仪器设备 ......................................... 50
第五章 蓝莓酒渣花色抗氧化性研究 ..........................61
5.1 试验材料与仪器 ......................................... 61
5.1.1 主要材料与试剂 ..................................... 61
5.1.2 主要仪器设备 ..................................... 62
第五章 蓝莓酒渣花色抗氧化性研究
在抗氧化等功能性食品的研发过程中，通常通过体内和体外的抗氧化能力来衡量其抗氧化能力。由于体内实验受到诸多条件的限制，所以体外实验应用的更加广泛。通常体外抗氧化实验有 DPPH 法、羟基自由基清除法、抗超氧阴离子自由基清除法、ABTS 法和测定总抗氧化能力等方法。这些方法中每种方法都有各自的检测意义，通过不同方法得出的数据之间的相关性不大。本实验中采用了羟基自由基清除法、DPPH 法、抗超氧阴离子自由基清除法和总抗氧化能力的测定，对蓝莓酒渣花色苷纯化物和粗提物的抗氧化活性进行比较。
5.2.1 蓝莓酒渣花色苷对羟自由基的清除能力
参照 Blois 等[160]的方法略作改动，，配制 0.2mmol/L 的 DPPH 溶液，放于棕色瓶中在 4℃冷藏保存，在比色管中加入不同浓度的蓝莓酒渣花色苷溶液和 DPPH 溶液各 2mL，充分混合后在室温避光下放置 30min，在 517nm 处测定溶液的吸光值。空白组为 1.5mL 乙醇溶液和 1.5mL 一定浓度的蓝莓酒渣花色苷溶液；对照组为 1.5mL 乙醇溶液和 1.5mLDPPH 溶液，以 VC作为对照。清除率（E）计算公式如 5-2：
参照郭雪峰[161]方法略作改动，依次加入浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液5.7mL，样品溶液0.2mL，浓度为6mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混合反应4min，滴入2滴HCl终止反应，在320nm处测量。根据公式5-3计算出单位时间内吸光度值的变化，以VC作为对照。计算超氧阴离子的清除率公式如下：
二苯基苦味肼基自由基（DPPH）是一种稳定的有机自由基，可用来评价抗氧化物质的供氢能力，在517nm处有特征吸收峰，当DPPH中加入的被测物质中有抗氧化剂时，抗氧化剂就会与孤对电子配对，使其在517nm处的吸光度值减小。因此可根据吸光度值的变化来评价对DPPH自由基的清除能力[165]。
总抗氧化能力是物质的不同活性成分清除各种类型自由基的有效和，抗氧化活性物质在机体内起效果的是其总抗氧化能力，因此用总抗氧化能力(TAA)评价生物活性物质的抗氧化功能是非常重要的指标[167]。通常样品中抗氧化物质的含量与其总还原能力呈正相关，依据还原能力的测定原理，在波长 700nm 处测定的吸光值越大，则样品的还原能力越强。如图 5-1-A 和 5-1-B 所示，在一定的浓度范围内，蓝莓酒渣花色苷纯化物和粗提物的还原能力随质量浓度的增加而增大，且蓝莓酒渣花色苷的总抗氧化能力随质量浓度的增加而增强，说明吸光度和质量浓度基本上呈现正比关系；且在不同质量浓度下，蓝莓酒渣花色苷纯化物的总还原能力均高于粗提物。但纯化物和粗提物的总抗氧化能力均低于 VC，蓝莓酒渣花色苷纯化物和粗提物的浓度为 20μg/mL 时，吸光值分别为 0.139 和 0.083，VC的浓度为 20μg/mL 时，吸光值达到了 0.652，VC的总抗氧化能力是蓝莓酒渣花色苷纯化物的 4.7 倍和 7.5 倍。
......
第六章 结论与建议
花色苷有抗癌、抗炎等作用，是目前食品的人们研究对象。本文创新性的从蓝莓酒渣中提取花色苷，采用溶剂提取法提取野生和种植酒渣中花色苷、总酚和总黄酮含量的差异，并达到了较好的提取效果，并对野生蓝莓酒渣粗提物通过大孔树脂法进行纯化，并用反相高效液相色谱质谱对蓝莓酒渣花色苷进行组成成分分析，对纯化后的蓝莓酒渣花色苷产品进行稳定性和抗氧化性研究，结果表明其稳定性极差，但抗氧化性极强。
（1）溶剂提取法提取野生和种植两种蓝莓酒渣中花色苷的工艺参数，得到最佳的提取工艺参数。野生蓝莓酒渣最佳实验参数为：提取剂为 40 %乙醇，添加 0.1 %的盐酸，料液比 1：40，30℃提取 1 h，提取液中花色苷含量为 3.03 mg/g，总酚 4.52 mg/g，总黄酮 1.85mg/g，粗提物得率 22.1 %，花色苷纯度 1.37 %。种植蓝莓酒渣最佳实验参数为：提取剂为40 %乙醇，添加 0.1 %的盐酸，料液比 1：30，30℃提取 1 h，提取液中花色苷含量为 2.14 mg/g，总酚 3.34 mg/g，总黄酮 1.37 mg/g，粗提物得率 17.6 %，花色苷纯度 0.89 %，结果表明，野生蓝莓酒渣中残留花色苷、总酚和总黄酮含量均高于种植蓝莓酒渣，粗提物得率和花色苷纯度也由于种植蓝莓酒渣。
（2）蓝莓酒渣花色苷纯化实验采用树脂法对蓝莓酒渣粗提物进行纯化。通过静态吸附解吸实验比较 5 种型号的大孔树脂对蓝莓酒渣的吸附能力，结果显示 NKA-II 型大孔树脂对蓝莓酒渣花色苷纯化效果较好。NKA-II 型大孔树脂对蓝莓酒渣花色苷纯化的工艺条件为：蓝莓酒渣花色苷粗提液上样浓度为 0.8mg/mL，pH 调整为 3，上样流速为 1mL /min，洗脱剂为体积分数 40%乙醇溶液，洗脱流速为 1.0mL/min。纯化后蓝莓酒渣花色苷产品为紫黑色粉末，色价为 90.57，纯度为 27.6%。并从纯化物中检测出 5 种花色苷单体，推测为芍药色素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-半乳糖苷、牵牛花色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3 葡萄糖苷、锦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷。
......
参考文献（略）
本文编号：36399
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/36399.html
