西藏灵菇发酵乳多糖的性质表征及菌粒形成的微生物基础

发布时间：2016-05-03 06:12

第一章 文献综述

1.1 微生物多糖的研究概况
微生物多糖作为多糖的一个重要来源，包括细菌多糖、真菌多糖和蓝藻多糖，与动植物多糖相比，其生产发酵不受季节、地域环境和病虫害等自然因素的限制，培养条件可控，生产周期短，质量和产量稳定，安全无毒，理化性质独特。因此，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。微生物多糖的生物合成积累均发生在微生物生长期以后，根据其在细胞内不同的存在形式，通常被分为三种类型：（1）胞内多糖（Intracellularpolysaccharide），构成微生物细胞成分，为细胞提供碳源和能量；（2）细胞壁多糖（Cellwall polysaccharide），粘附在细胞表面，维持细胞结构的稳定，包括肽聚糖和脂多糖；（3）胞外多糖（Exopolysaccharide），分泌到培养基中的菌表多糖，包括荚膜多糖和生物被膜多糖。
近年来，微生物多糖作为乳化剂、凝胶剂、稳定剂、悬浮剂、保鲜剂、增稠剂、成膜剂、润滑剂等，在食品、制药、化工、石油及生物工程等多个领域得到广泛应用（Ruas-Madiedo et al. 2002； Welman and Maddox 2003），另外，微生物多糖还具有免疫调节、降低胆固醇、抗肿瘤及抗炎症等医学或保健功能（Diniz et al. 2003； Rizk et al. 2009；Vinderola et al. 2005）。微生物多糖的重要生物学效应也日益被人们所重视，因此它也成为当今医药和食品工业共同关注的焦点，也是当今研究的热点领域之一。
1.1.1 生物学活性
1.1.1.1 抗氧化活性

在正常的新陈代谢过程中机体产生的自由基为具有一个或者几个不配对电子的原子或原子团，具有一定的稳定性和高度氧化性，参与细胞增殖、坏死、凋亡、分化等多种生理现象（Finley et al. 2011）。在正常状态下，氧化过程为机体提供能量，机体的氧化与抗氧化处于一种动态平衡中（Abdhul et al. 2014）。但是，过量的自由基如羟基自由基（ OH）、超氧阴离子自由基（ O2-）、过氧化氢（H2O2）、活性氧（ROS）会破坏机体内自由基稳定平衡的动态，导致氧化应激反应的产生（Guo et al. 2012），引发机体病变如癌症、肺损伤、糖尿病及动脉硬化、炎症等（Sayre et al. 2008）。外源性抗氧化剂可以通过阻断自由基链的氧化和提供氢离子来阻止自由基链的氧化（Xu et al.2011）。随着人们对微生物多糖及其复合物的抗氧化活性作用的深入研究，越来越多的具有抗氧化活性的微生物多糖被发现。Asker 等（2009）发现 Microbacterium terregens产胞外多糖具有显著清除自由基的活性，其中组分 CPSI 清除 DPPH 自由基的 IC50仅为230 μg/mL。Xu 等（2011）报道从 Bifidobacterium animalis RH 发酵液中提取的胞外多糖具有清除羟基自由基、DPPH 自由基和超氧阴离子的体外抗氧化活性，同时，体内抗氧化的试验表明，D-半乳糖诱导的衰老鼠在口饲 30 天后，其血清中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）和总抗氧化能力与肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性都有显著的提高。Bacterium Bordetella sp.产胞外多糖清除 ABTS、H2O2、 OH 自由基和脂质过氧化的能力分别是维生素 C 的 2、86、134 和 18 倍，而且对 AAPH 诱导的 DNA 损伤具有显著的保护作用（Xu et al. 2011）。Zhang 等（2012）报道 Lactobacillusplantarum 产胞外多糖可以降低自由基和 H2O2诱发的小鼠肝组织中丙二醛（MDA）的生成。

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1.2 西藏灵菇的研究进展
西藏灵菇（Tibetan Kefir），类似于 kefir 粒，是 kefir 的一个品系，源自西藏高原的特有珍稀菌种，是我国独有的世界珍宝。西藏灵菇是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等微生物在多糖的环境中，经过长期的相互适应与协同作用形成的非常复杂的菌相共生体系，即菌粒（Marshall and Cole 1985）。西藏灵菇菌粒呈乳白色或淡黄色，状如蒸熟的米粒，有弹性，在牛奶中长期培养，个体会增大变多，形状如盛开的雪莲，故又被称为“西藏雪莲”。西藏灵菇发酵乳与传统的酸奶相比，最显著的特征是除了乳酸发酵以外，还伴有轻微的由酵母引发的酒精发酵，因此，它不仅具有发酵酸奶特有的酸味和香味，还有轻微的醇香味（周剑忠等 2006）。但是，由于西藏灵菇的微生物组成比较复杂，采用传统的发酵剂传代方法进行扩大生产，极易造成菌相失衡，导致发酵乳的风味和品质的变化，失去原有的优良特征，从而，限制了其工业化生产。目前这种产品主要通过西藏灵菇菌粒的传递在民间流传。
1.2.1 西藏灵菇的微生物组成

西藏灵菇的菌相十分复杂，不同地区不同培养条件下的西藏灵菇菌种差别很大。表1-1 列出了目前文献报道的分离自不同批次的西藏灵菇中的乳酸菌、醋酸菌和酵母菌。从表中可以看出，从西藏灵菇中分离到的乳酸菌和酵母菌较多，醋酸菌较少。酵母菌多属于假丝酵母属和克鲁维酵母属，均属好氧菌，条件适宜时，在 20-30 ℃下仅需几个小时就能繁殖一代；乳酸菌多为乳杆菌、乳球菌和明串珠菌，这些菌均为兼性厌氧或微好氧。醋酸菌的种类较少，目前报道的只有醋杆菌、冲绳醋酸菌、东方醋酸菌。

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第二章 西藏灵菇多糖的基本特性与抗氧化活性

氧化是机体内一个重要的生化过程，在正常状态下，自由基和氧化过程为机体提供能量，机体的氧化与抗氧化处于动态平衡中（Abdhul et al. 2014）。但是，过量的自由基如羟基自由基（ OH）、超氧阴离子（ O2-）、过氧化氢（H2O2）及活性氧（ROS）会破坏机体内自由基稳定平衡的动态，导致氧化应激反应的产生（Guo et al. 2012），损坏细胞中的蛋白质、脂质和 DNA（Salvemini et al. 1999），引发机体病变如各种癌症、肺损伤、糖尿病及动脉硬化、炎症等（Sayre et al. 2008）。外源性抗氧化剂可以通过阻断自由基链的氧化和提供氢离子来阻止自由基链的氧化（Xu et al. 2011）。但是，人工合成的抗氧化剂如叔丁基对苯二酚（TBHQ）、二丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）与丁基羟基茴香醚（BHA）等会造成肝损伤并会引发癌症（Grice 1988），因此，对广谱、安全、高效的天然抗氧化剂的研究开发已经成为当今食品、日化和药品等领域的热点。

西藏灵菇（Tibetan kefir）是 kefir 粒的一种，来源于中国西藏，是由酵母、乳酸菌和醋酸菌多种微生物形成的一个共生菌相，在其生长繁殖过程中会分泌胞外多糖（Exopolysaccharide）（孟利和张兰威 2006；Zhou et al. 2009）。据报道，西藏灵菇发酵乳具有抑菌、抗炎症、抗肿瘤和免疫调节作用（Diniz et al. 2003；Liu 2002；Rodrigues etal. 2005；杨希娟等 2007），这些生物活性很可能与发酵乳中的多糖有关（Maeda et al.2004；Piermaria et al. 2011；Rodrigues et al. 2005）。因此，本章在对西藏灵菇发酵乳中的多糖进行提取和分离纯化的基础上，研究其对 DPPH 和 ABTS 自由基的清除能力、对铁的还原能力及对 AAPH 和 Cu2+/H2O2诱导的蛋白损伤的保护作用，以评价其体外抗氧化活性。同时，对其基本的理化性质，包括单糖组成、微观结构和热学特性进行了分析，为西藏灵菇多糖的开发利用提供理论参考。

2.1 材料与仪器设备
2.1.1 菌种

新鲜牛乳，采购于西北农林科技大学畜牧养殖场；2，2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐（2, 2’-Azinobis （3-ethylbenzenothiazoline-6-sulphonic acid，ABTS）、水溶性维生素 E（6-hydroxy-2, 5, 7, 8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、1，1-二苯-2-苦基肼（2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，，DPPH）、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪(1, 3, 5-tri（2-pyridyl）-2, 4 , 6-triazine，TPTZ）、2，2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（2, 2’-azobis（2-aminopropane）dihyrochloride，AAPH）（Sigma，生化试剂）；考马斯亮蓝 R-250、牛血清白蛋白（BSA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯聚酰胺、甘氨酸、巯基乙醇、溴酚蓝、过硫酸铵、三磷酸腺苷[ATP]、二磷酸腺苷[ADP]（Amresco，生化试剂）；苯酚、浓硫酸（西陇化工股份有限公司，分析纯）；硼氢化钠（NaBH4）、吡啶、乙酸酐（科龙化工试剂厂，分析纯）；冰乙酸、甲醇（天津市博迪化工有限公司，分析纯）；三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；三氟乙酸（Aladdin，生化试剂）；其他试剂均为市售分析纯。

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2.2 试验内容与方法
2.2.1 西藏灵菇的复活
取存放于-40 ℃下的西藏灵菇菌粒，用无菌冷水反复冲洗 3 遍，再按 5 %的接种量接种至脱脂乳培养基中（Guzel-Seydim et al. 2000），25 ℃下静置培养 24 h（Garrote etal. 1998），然后用无菌金属网过滤，并用无菌冷水冲洗 3 遍，得到的西藏灵菇菌粒再转接至脱脂乳培养基中，如此重复培养复活，连续 3-5 次，即得复活后的菌粒。
2.2.2 西藏灵菇发酵过程中多糖含量的变化
取西藏灵菇菌粒，按 5 %的接种量接入脱脂乳培养基中，25 ℃下静置培养 24 h，每隔 4 h 取样，测定发酵乳中多糖含量的变化。每个处理做三个平行。
发酵结束后，将发酵乳加热至 100 ℃并维持 10 min，冷却至室温后 8000 rpm 离心15 min，收集上清，在蒸馏水中透析 24 h，采用苯酚-硫酸法测定上清中总糖的含量（Dubois et al. 1956），以葡萄糖为标准物，按表 2-1 所示试剂配方，将混合液摇匀，静止冷却后于 490 nm 处测定吸光值，绘制标准曲线。
2.2.3 西藏灵菇多糖的制备
西藏灵菇多糖的制备参照 Wang 等（2010）的方法，稍作修改。西藏灵菇菌粒按 5 %的接种量，接入脱脂乳培养基中，25 ℃下静置培养后，无菌条件下滤去菌粒，剩余的发酵乳在 100 ℃下加热 10 min，以溶解粘附在细胞表面的多糖（Wang et al. 2008），8000 rpm 离心 15 min 后去沉淀，上清液浓缩后加入三倍体积的 95 %的乙醇于 4 ℃下醇沉过夜，8000 rpm 离心 15 min 得到沉淀。沉淀溶于蒸馏水后，加入 1/5 体积的 10 %的三氯乙酸溶液，振荡 30 min 后，10000 rpm 离心 15 min 去沉淀，除去蛋白。调整上清pH至7.0后，加入三倍体积的95 %的乙醇于4 ℃下醇沉过夜，8000 rpm离心15 min，去上清，沉淀溶于蒸馏水，透析后冷冻干燥，即得西藏灵菇多糖。

等摩尔称取鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcA）及半乳糖醛酸（GalA），加入 90 mg 硼氢化钠与 6 mL 蒸馏水，震荡后，室温下还原 1.5 h；滴加 25 %（v/v）的冰乙酸至无气泡产生，以分解过量的硼氢化钠，60 ℃下减压蒸发至干，加入 4 mL 甲醇（含 1 %盐酸），减压蒸干，重复 5 次除去硼酸根。残渣溶于 6 mL 甲醇（含 1 %盐酸）中，72 ℃下烘干。向残渣中加入 0.7 mL 吡啶和 0.7 mL 乙酸酐，密封后于沸水浴中反应 1 h，所得样液过 0.25 μm 有机滤膜后进行 GC 分析。

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第三章 西藏灵菇多糖的流变学特性与乳化性质.......................27
3.1 材料与仪器设备............................................ 27
3.1.1 试验样品................................................. 27
3.1.2 主要试剂................................................ 27
第四章 西藏灵菇多糖的组分分析与结构解析........................39
4.1 材料与仪器设备............................................. 39
4.1.1 试验样品................................................... 39
4.1.2 主要试剂.................................................. 39
第五章 西藏灵菇中的多糖产生菌及其多糖的基本特性与活性 ...........53
5.1 材料与仪器设备.............................................. 53
5.1.1 菌种....................................................... 53

5.1.2 培养基...................................................... 53

第六章 西藏灵菇菌粒形成的微生物基础

西藏灵菇（Tibetan kefir）是 Kefir 的一种，与 kefir 的菌相构成与粒的特征相似。Kefir 现代的生产是基于连续的牛奶发酵，菌粒微生物的生长繁殖和菌粒生物质的产生使生物量每天增加 5 %-7 %（Libudzisz and Piatkiewicz 1990），其中包括蛋白和多糖的分泌合成。Wang 等（2012）认为与菌粒形成相关的微生物群可以看做是一个菌膜（Biofilm），控制菌膜形成的过程包括大分子物质粘附表面的形成、细胞的粘附、细胞间的相互作用与复合菌系的生长繁殖（Sim es et al. 2010）。微生物菌群的表面粘附和菌膜的形成是一个非常复杂的过程，与细胞的表面特性，特别是细胞的自聚集（Auto-aggregation）特性紧密相关（Sim es et al. 2010）。

迄今为止，Kefir 和西藏灵菇只能在原有的菌粒基础上进行生长繁殖（Schoevers andBritz 2003），有很多研究试图用 kefir 粒中常见的菌种进行单菌或者复合菌培养来形成kefir 粒，但是由于对菌粒形成机制尚不了解，最后都没有成功（Libudzisz and Piatkiewicz1990；Liu and Moon 1983）。本章对从西藏灵菇菌粒中分离得到的 10 株乳酸菌、醋酸菌和酵母菌的细胞表面性质和菌膜形成能力进行了分析，以了解它们在西藏灵菇菌粒形成过程中起到的作用；研究酵母菌与乳酸菌和醋酸菌之间的相互作用，明确菌粒形成的可能机制；对从西藏灵菇中分离得到的 15 株菌进行复配，研究混合培养转接过程中“菌粒”的形成情况，对混合培养的发酵乳和西藏灵菇发酵乳中的挥发性物质进行对比和分析。

6.1 材料与仪器设备
6.1.1 菌种
第二章 2.2.1 中复活好的西藏灵菇样品。
第五章分离纯化得到的纯培养物，分别为：
RJ-5、RJ-1、RJ-2，假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）；JM-4、JM-6，乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. Lactis）；RJ-4、CJ-2、CJ-3、CJ-4，冲绳醋酸菌（Acetobacter okinawensis）；JM-1，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；JM-2、JM-3、JM-5、JM-7、JM-8，单胞酿酒酵母（Kazachstania unispora）。
6.1.2 培养基

（1）脱脂乳培养基：新鲜牛乳在 4000 rpm 下离心 10 min，每 100 mL 分装于 250 mL的锥形瓶中，105 ℃下灭菌 20 min。

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第七章 结论、创新点与展望

7.1 结论
西藏灵菇菌粒是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等多种微生物在发酵的过程中，经过长期相互适应与协同作用的过程中形成的一种多菌种共生体，推测多糖是促进这种共生体形成的主要组成成分，也是赋予西藏灵菇发酵乳以提高免疫力、抗癌、防癌、降血糖等功效的主要成分。然而，目前有关西藏灵菇菌粒的微生物菌群、菌粒形成的内在机制以及西藏灵菇发酵乳多糖的活性与理化性质等方面的研究还少有报道。此外，西藏灵菇菌粒中的微生物菌群会随着发酵环境的改变而变化，从而导致发酵过程不稳定，产品质量难以保证。为此，本文在对西藏灵菇发酵乳多糖进行分离纯化的基础上，研究其单糖组成、表观微观结构、抗氧化活性、流变学特性、乳化性质、组分构成、主要组分及结构特征；对西藏灵菇菌粒和发酵乳中的微生物进行分离纯化、菌群分析，对单菌株在发酵乳中所产多糖的特性，以及多菌种复配后菌粒的形成情况进行了研究，获得以下主要结论：
（1）西藏灵菇多糖的基本特性与抗氧化活性。对西藏灵菇多糖进行分离纯化及理化性质分析后得出，该多糖为中性多糖，由葡萄糖和半乳糖组成，两者的摩尔比为1:1.88；多糖的表面呈粗糙的颗粒状，结构致密；熔点为 131.46 ℃，热焓值为 209.6 J/g，热稳定性好；能够有效地清除 DPPH 和 ABTS 自由基，还原 Fe3+离子，对 AAPH 和Cu2+/H2O2诱导的蛋白损伤具有较强的保护作用。
论文对西藏灵菇发酵乳多糖的理化特性、流变学特性、组分构成等方面进行了较为全面的研究，研究结果可为该多糖的综合利用提供重要的理论依据；此外，论文还从西藏灵菇菌粒及发酵乳中的微生物菌种组成，每种微生物的多糖产生特性，以及菌粒分离菌的成膜性、聚集性等方面进行了分析研究，探讨了西藏灵菇菌粒形成的微生物基础；而且通过菌种复配成功地得到了初步成形的多菌种共生体。这些结果可为西藏灵菇菌粒的人工控制与质量保证提供重要的理论基础。然而，受制于现有试验技术和论文执行期的时间限制，有关西藏灵菇发酵乳多糖和菌粒形成机制方面还需要在以下几个方面进行进一步研究与补充完善：

（1）西藏灵菇发酵乳多糖的核磁分析结果没有拿到。作者经过多次努力，企图通过核磁分析的方法获得该多糖中有关糖苷键等更为详细的结构信息，但是，即使该多糖经过多次分离纯化，由于其黏性很大，溶解性差，在核磁共振测定中的信号很差，没有得到更充分的核磁数据来进一步佐证多糖的结构。在后续研究中，或许可以通过高温核磁共振仪等其它检测手段解决这一问题。

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参考文献（略）

本文编号：41362