苹果根皮素糖基转移酶的基因表征及功能分析
第一章 文献综述
我国是苹果的主产区，根据联合国粮食及农业组织 FAO 2014 年统计数据，中国苹果种植面积达到 222 万公顷，年产量约 3850 万吨，种植面积和年产量均占世界的一半，均居世界首位。中国苹果有黄土高原、渤海湾、黄河故道和西南冷凉高地四大产区，根据气候和生态适宜原则，西北黄土高原产区和渤海湾产区是中国最适合苹果发展的产区，陕西省凭借地理优势，在种植面积、年产量和苹果浓缩汁出口等方面均居全国前列。2012 年种植面积 1000 万亩、年产量达 1000 万吨。浓缩汁产量 50 万吨，其中九成用于出口，产品销往欧盟、北美、中东、日本等国家和地区。苹果酸甜可口，营养丰富，含有多糖（刘铁铮等 2004）、脂肪、果胶（Schieber etal.2003）、粗纤维、钾、钙、磷和微量元素锌、铁（张莉等 2009）及维生素 B1、维生素 B2、维生素 C（Odriozola et al. 2007），还富含多种生物活性物质，三萜类、甾醇、多酚等。
苹果中所含多元酚类物质通称为苹果多酚（Shaoji et al. 2004），分为中性酚和酚酸，主要的中性酚有根皮苷、根皮素、儿茶素、表儿茶素、原花青素类等，主要的酚酸有绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、P-香豆酸等（吴燕华等 2002）。Alonso-Salces 等（2004）运用高效液相色谱联用质谱及二极管阵列检测的方法，在苹果中检测到多达 30 种多酚化合物及聚合体，但大多数学者认为，苹果多酚的主要成分包括黄酮醇类（槲皮苷配糖体）、黄烷-3 醇类、二氢查耳酮类（根皮苷配糖体）、花色苷类、羟基肉桂酸类等。苹果多酚有多种生理功能，近年来，许多科研工作者发现苹果多酚有极强的抗氧化活性（Biedrzycka andAmarowicz 2008；Lu and Yeap 2000），具有抗菌消炎（Chanwitheesuket al.2007; Sul et al. 2009; Jung et al. 2009）、预防冠心病（Weichselbaum et al. 2010）、抗肿瘤（Selvaraju et al. 2007; Shao et al. 2011）、抗辐射（Chaudhary et al.2006）等多种药理功能。
苹果多酚的种类和含量因品种、部位、成熟度、环境等因素不同而有很大差异，杜中军（2002）的试验结果表明在嘎拉苹果品种的果皮中发现了花青素——山越橘苷，而金冠苹果的果皮中没有检测到；金冠苹果的果肉中含有槲皮苷，而嘎拉苹果的果肉中却没有检测到；金冠的根皮苷含量高于嘎拉。Tsao等（2003）研究发现果皮中单体和聚合的黄烷-3-醇占总酚的60%，黄酮醇占18%，羟基肉桂酸占9%，二氢查尔酮占8%，花青素占5%；果肉中原花青素占56%，羟基肉桂酸占40%，二氢查尔酮占4%。 ata 等（2009）研究发现苹果50%的根皮苷存在于果皮中，而果皮只占全果重的6-8%，此外，其他的一些文献也发现了类似的结果（Alonso-Salces et al.2004; McGhie et al.2005; Veberic etal.2005; Petkov ek et al.2007）。而Hagen 等（2007）和Kondo 等（2002）发现在幼果期和采收前期果肉的原花青素B1、原花青素B2、绿原酸、儿茶素、表儿茶素含量比果皮高。唐传核（2001）发现原花青素、儿茶素及绿原酸是成熟期苹果的主要多酚，而二氢查耳酮、黄酮醇类化合物在未成熟苹果中含量较多。Zhang 等（2010）发现蜜脆苹果果肉中主要的多酚为原花青素 B1 (81.40 ± 3.72μg/gFW) 、原花青素 B2 (54.35 ± 2.54μg/g FW) 、绿原酸(52.93 ± 4.81μg/g FW) 、儿茶素(44.69 ±2.13μg/g FW)、表儿茶素(10.42 ± 0.68μg/g FW) 等。Dabrosca 等（2007）在研究 ‘Limoncella’（产自意大利）苹果时，也发现类似的结果。
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根皮苷是苹果多酚中最具代表性的一种多酚类成分，法国化学家于 1835 年从苹果树皮中分离得到（Ehrenkranz et al.2005）。它对苹果及其产品的风味、色泽有重要的影响（Fromm et al.2012; Veitch et al.2008）。根皮苷具有多种生物活性，如可调节血压、降低血糖（Wang et al.2007）、清除体内自由基（Lu et al.2000）、保护心脏（Ehrenkranzet al.2005）、预防和治疗糖尿病等（董华强和宁正祥 2006），已应用于医药、化妆品、组织培养、保健食品等方面（冯雪娇 2008; Lavelli et al.2011; Ma et al.2012）。根皮苷作为特征多酚，也在苹果汁质量控制和鉴定中得到了应用（苏光明等 2010）。
1.2.1 根皮苷的结构与性质
根皮素（Phloretin）的 R1、R2、R3 和 R4 位被不同的基团取代，形成各种衍生物，根皮苷是最重要的一种。根皮苷属于植物黄酮类中的二氢查尔酮苷，是根皮素的葡萄糖苷，其分子骨架为 C6-C3-C6（两个苯环通过一个 C3链连接）结构，在 2’位上连接一分子的 β-D-吡喃葡萄糖，结构式如图 1-1（引自 Gosch et al.2010a），分子式 C21H24O10，分子量：436.41。根皮苷溶于热水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，不溶于醚、氯仿。
糖基化是由糖基转移酶（glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y）催化的一种重要的翻译后修饰过程。它通常是将核苷酸-糖供体中的单糖转移到其他的碳水化合物、蛋白或脂上，形成糖苷键。植物常见的糖供体有尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖醛酸等。糖基化通过调节细胞重要代谢物的水平、活性和位置在植物自动调节方面起重要作用。植物细胞的某些活性膜转运系统只识别糖苷不识别苷元，通过糖基化增加化合物亲水性改变其溶解性，使其通过该系统（Li et al.2001; Gachon et al.2005）。糖基化能增加化合物在植物细胞的稳定性，促进其贮存和积累（Jones and Vogt 2001; Bowles et al.2005）。同时，也是决定天然产物生物活性和生物利用度的重要因素之一（Ross et al.2001；Bowles et al.2006）。例如槲皮素，属于黄酮类，一种有效的抗氧化剂，可以在不同位点被引入各种糖基，大约有 300 多种槲皮素糖苷，这些糖苷有不同的生物活性（Harborne and Baxter 1999）。又如，在柚皮素 7-O-葡萄糖苷的 2-OH 或 6-OH 引入一个鼠李糖能使葡萄柚变苦或使柑橘变得无味（Frydman et al.2004）。甜叶菊（Stevia rebaudiana）叶中含有的双萜糖苷——甜菊苷和莱苞迪苷 A 是强力甜味剂，它们不同的糖基化形式决定其甜度（Richmanet al.2005）。此外，植物糖基转移酶在外源物脱毒和调节激素活性方面也起重要作用。例如，拟南芥 UGT73C5 糖基化甾类激素和油菜素内酯，降低其生物活性（Poppenbergeret al.2005）。
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第二章 苹果根皮素糖基转移酶基因克隆及原核表达
植物糖基化的作用是通过增加亲水性改变苷元的溶解性，提供进入膜转运系统的途径，这种系统只能识别糖苷，而不能识别苷元。糖基化通过调节重要细胞代谢物的水平、活性和定位的功能在保持细胞内平衡方面起到很大的作用。某些糖基化反应参与植物体内激素的平衡调节。另外糖基化还能降低或除去内源和外源物质的毒性。糖基转移酶具有底物特异性，故植物中含有多种糖基转移酶，如甜叶菊苷糖基转移酶（Fordet al.1998）、花青素糖基转移酶（Ogata et al.2005）、染料木素糖基转移酶（Sawada etal.2005）、查尔酮糖基转移酶（Davies et al.2006）、槲皮素糖基转移酶（Noguchi et al.2007）、红景天苷糖基转移酶（于寒松 2008）、人参皂苷 Rh2葡萄糖基转移酶（何彦平 2010）、葛根素糖基转移酶（刘吉升等 2011）等。本章基于 PCR 的 cDNA 基因克隆技术对 3 个苹果根皮素糖基转移酶进行了克隆测序、生物信息学分析并构建 pET32a-UGT88F1 表达载体，转化到大肠杆菌 BL21(DE3)诱导表达酶蛋白，为进一步研究苹果根皮素糖基转移酶的酶学性质及分离纯化提供了理论依据。
2.1.1 材料
2.1.1.1 植物材料
样品为 20 d 叶龄叶片，采自西北农林科技大学园艺场马锋旺教授种植的十年生黄元帅（Golden Delicious）苹果树，叶片用锡箔纸包裹，液氮速冻，-80℃保存。
2.1.1.2 菌种及质粒
大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)，实验室保存；pMD18-T 克隆载体，TakaRa 公司；pET-32a(+)表达载体，Novagen 生物公司。
2.1.1.3 试剂
PrimeScript Reverse Transcriptase reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒、Ex Taq酶、100bp 和 DL5000 DNAmarker、限制性内切酶（HindⅢ、EcoRⅠ、KpnI、PstI、SalⅠ）均购自 TaKaRa 公司；琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，，百泰克公司；SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒，上海生工公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷（X-gal）、氨苄青霉素（Amp）为 Sigma 公司产品；质粒提取试剂盒 TIANprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa PremixTaq 试剂盒，T4 ligase，BamHⅠ和 HindⅢ内切酶购于 TaKaRa；单克隆 Anti-His 抗体，天根生化科技（北京）有限公司；辣根酶标记山羊抗鼠 lgG（H+L），碧云天生物技术公司；蛋白 Marker，预染型 Western Marker，EasyECLWestern Blot Ki（tDW101），TRANS公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），牛血清蛋白（BSA），Sigma 公司；其他试剂均为分析纯。
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2.2.1 糖基转移酶基因克隆
提取苹果组织总 RNA 经 1.0% ( W /V ) 琼脂糖凝胶电泳，结果见图 2-2。28S 与18S 处亮度比约 2 ∶ 1，RNA 条带基本无降解， A260/A280比值在 2.0-2.1，电泳条带清晰整齐，无弥散现象，说明总 RNA 的完整性和纯度都很好，可以用于下游的反转录扩增。
将由苹果叶片 RNA 扩增的基因片段与克隆载体连接后转化大肠杆菌 DH5 α , 蓝白斑法筛选得到的阳性菌落，分别挑取单克隆进行培养，提取质粒 DNA，经双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳见图 2-4，1500 bp 左右处的条带为目标条带，3000 bp 左右处的条带为质粒条带。结果表明苹果根皮素糖基转移酶基因已克隆至 pMD18-T 载体上。
2.2.2 糖基转移酶基因生物信息学分析
将测序结果在 NCBI 上 blast，与目标基因均差 2 个碱基，匹配度 99%，说明成功克隆出 3 个糖基转移酶基因。从获得的 3 个糖基转移酶基因的信息得知，UGT71A15、UGT71K1 和 UGT88F1 基因 cDNA 长度分别为 1416、1434 和 1452 bp，基因编码蛋白的氨基酸残基数目分别为 471、477 和 483 个。
2.2.2.1 同源性分析
将克隆的三个糖基转移酶氨基酸序列与一些其他的糖基转移酶（查尔酮糖基转移酶AmC4’GT、 LvC4’ GT、异黄酮糖基转移酶 GmIF7GT、花青素糖基转移酶 RhGT1，见表2-14）氨基酸序列进行比对，采用 MEGA4.1 软件的 neighbor-jointing 法建立系统发育树，见图 2-5。结果表明，UGT88F1 和 UGT88F 家族的同源性较高，苹果的 UGT71A15 和梨的 UGT71A16 同源性较高，苹果的 UGT71K1 和 梨的 UGT71K2 同源性较高。
登陆 NCBI 网站，进行氨基酸序列 Blastp 比对，结果如表 2-15，由表可知，UGT88F1与 UGT88F 家族的同源性较高，达到 79.9～99%，但是与 UGT88 家族其他亚家族的同源性并不高，只有 34.2～53%。UGT88F1 与紫苏（Perilla frutescens）的 UGT88A7（AB362992）具有 51%的同源性，与绿毛山柳菊（Hieracium pilosella）的 UGT88A8（EU561017）具有 53%的同源性，与蔷薇属的杂交品种（Rosa hybrid cultivar）花青素5,3-O-糖基转移酶 RhGT1（AB201048）具有 43.9%的同源性，与金鱼草（Antirrhinummajus）糖基转移酶 AmC4'GT（AB198665）具有 41.2%的同源性。UGT71A15 除与UGT71A16 具有 92%同源性外，与其他糖基转移酶具有 32.7～58%的同源性。UGT71K1除与 UGT71K2 具有 94%同源性外，与其他糖基转移酶具有 33.2～46.6%的同源性。
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3.1 材料与方法....................................... 46
3.1.1 材料..................................... 46
四章 生长期苹果不同组织根皮苷含量和根皮素糖基转移酶酶活变化研究.......56
4.1 材料与方法................................................. 56
4.1.1 材料..................................... 56
4.1.2 方法..................................... 56
4.2 结果与分析................................................... 58
第五章 苹果根皮素糖基转移酶分离纯化及酶学特性....................66
5.1 材料与方法................................................... 66
5.1.1 材料 ..................................... 66
5.1.2 方法 ..................................... 66
第六章 苹果叶多酚的抗氧化性及抗菌性研究
6.1.1 材料
6.1.1.1 苹果原料
见第五章 5.1.1.1。
6.1.1.2 试剂
根皮苷标准品（纯度>99.8%），美国 Sigma 公司；原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素 B2、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、没食子酸和茶多酚等标准品，上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）， 三吡啶三吖嗪（TPTZ），2,2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS），Folin-酚试剂，上海 Solarbio公司；色谱甲醇，美国 TEDIA 公司；2,6- 二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等其他试剂为分析纯。
6.1.1.3 受试菌
大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、鼠伤寒沙门氏菌 LT2（Salmonella typhimurium LT2）、志贺氏菌（Shigella）和阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii）共 5 种，由西北农林科技大学食品学院微生物实验室提供。
6.1.1.4 仪器设备
Waters 高效液相色谱（含 1525 二元泵，2998 双通道紫外检测器，2707 自动进样器，Breeze 色谱管理软件等）， 美国 Waters 公司；SHB- Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；R-200 型旋转蒸发器，瑞士 BüCHI 公司；cp2245 型分析天平，德国 Sartorius 公司；Milli-Q 超纯水仪，美国 Millipore 公司；KH-250DE 型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；UV-2800 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器公司；LDZX-40KB 不锈钢立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。6.1.2 方法
6.1.2.1 样品制备
参照 Drogoudi et al（.2008）的方法，准确称取 1.00 g 苹果叶样品于研钵中，加 10 mgVC 防止氧化，加入 30mL 甲醇，充分研磨，移到 100 mL 三角瓶中，超声提取 30 min，用旋转蒸发仪 40 ℃下浓缩至干，用甲醇溶解残留物定容至 10 mL，此为苹果叶多酚样品液，过 0.45 μm 滤膜，用 HPLC 分析苹果籽多酚组成，样品液稀释 100 倍后用于总酚测定和抗氧化活性分析。取 0.2 g VC，用水定容至 100 mL，取 0.1 mL 用水定容至 10 mL，此 VC 溶液的浓度为 20 μg/mL。取 0.2 g BHT，用甲醇定容至 100 mL，取 0.1 mL 用甲醇定容至 10 mL，此 BHT 溶液的浓度为 20 μg/mL。20 μg/mLVC 和 20 μg/mL BHT 溶液用于抗氧化活性分析的对照。
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本文以具有代表性的早、中、晚熟苹果为对象，对苹果根皮素糖基转移酶基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达、表达量分析；研究生长期内 7 个品种苹果不同组织根皮苷含量变化与酶活的关系；研究根皮素糖基转移酶分离纯化及酶学特性；研究苹果多酚的抗氧化性及抗菌性等。主要结论如下：
7 个品种苹果在生长期内芽、叶片、果皮、籽中根皮苷含量差异显著，叶片中根皮苷的含量最高，依次为芽、籽，果皮中含量较低。生长期内 7 个品种苹果叶片、果皮、籽根皮苷含量变化都呈现一定的规律性。苹果芽、叶片和果皮根皮苷含量与MdP2’GT 酶活呈正相关性。
建立根皮素糖基转移酶纯化方法，纯化倍数为71.0倍，比酶活达到632.0 U/mg，回收率达到 42.6%。SDS-PAGE 鉴定其表观分子量为 50 kDa。酶的最适 pH 值为 8.5，最适温度为 45 ℃，金属离子在反应体系的终浓度为 5 mM 时，Ca2+和 Mg2+对该苹果根皮素糖基转移酶有促进作用，Na+和 K+作用不明显，Al3+、Cu2+、Mn2+和 Zn2+有显著的抑制作用，Cu2+的抑制作用最强。以根皮素为底物测定 Km为 3.16μM，Vmax为0.77 nM/min·mg 蛋白。
7 个品种苹果叶中，秦冠抗氧化能力最强，秦阳和红盖露较强，蜜脆、富士、红星和黄元帅较弱。根皮苷清除自由基的能力介于 VC 和 BHT 之间。秦冠苹果叶多酚和其含有的各种多酚对受试菌都显现出抑菌活性，抑菌效果明显优于其含有的各种单酚，其抑菌性是茶多酚的 3~4 倍。根皮苷不含邻位羟基对受试菌的抑菌效果弱于绿原酸、儿茶素等含有邻位羟基的酚类。
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参考文献（略）
本文编号：44465
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/44465.html
