欧洲葡萄芪合酶基因的克

发布时间：2016-06-07 11:18

1 绪论 

1.1 葡萄的生物学研究概况 
葡萄（Vitis）属落叶藤本植物，同属植物约有 60 多种，其中 20 多种果可食或作砧木用，葡萄是世界上最古老的果树之一，几乎占全世界水果产量的四分之一。除果实能够用来生食外，还可酿酒或制葡萄干等；根、藤等可以入药，具有非常高的营养价值；欧洲葡萄(Vitis  vinifera)的栽培历史长达 5000 多年。全世界约有 80%的葡萄生产用于酿酒，由于葡萄酒具有多种保健功能，有益于身体健康，因此许多国家对葡萄酒的购买力不断增加。世界范围内关于葡萄的产业研究及相关的分子生物研究一直是个热点。研究者已经完成葡萄基因组测序，因而为进一步研究葡萄家族基因提供了便利条件，同时对葡萄家族基因的研究和分析也将为其功能、进化关系和基因表达等方面的研究提供科学参考。
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1.2 芪类化合物的研究进展 
芪类化合物是植物在抵御生物、非生物胁迫及环境恶化条件下产生的植保素。近年来，研究者发现一些芪类化合物有抑制人的皮肤真菌和皮肤细菌、抗血小板凝集、抗低密度脂蛋白氧化、调节雌激素、抗增殖、诱导细胞凋亡、抗癌抗氧化等医疗保健功能，这引起了人们极大的兴趣和广泛关注。芪类化合物以二苯乙烯为结构母核，广泛存在于葡萄等植物中，多数分布在植物的木质部，最早从蓼科植物大黄中被发现[1,2]。目前，研究者已从23科59属植物中分离得到芪类化合物[1]，并且发现一些微生物如酵母[3]、链霉菌属[4]和细菌[5]中也存在芪类化合物。 芪类化合物的合成来源于苯丙氨酸代谢途径[6]。苯丙氨酸首先在苯丙氨酸裂解酶(PAL)催化下裂解为肉桂酸，然后在肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)的作用下形成反式香豆酸，在香豆酸-CoA 连接酶(4CL)催化下形成反式香豆酰-CoA，1 分子的反式香豆酰-CoA 和 3分子的丙二酰-CoA可在芪合酶(stilbene synthase,STS)的作用下合成芪类次生代谢物白藜芦醇（resveratrol,Res）；或者由肉桂酸直接形成肉桂酰-CoA，之后与丙二酰-CoA 在芪合酶作用下合成另一种芪类化合物赤松素(pinosylvin)（图 1.1）。此外，反式香豆酰-CoA等也能够在查尔酮合酶（chalcone  synthase,CHS）的催化作用下进入黄酮类和异黄酮类合成支路[7]。因而得出结论，芪合酶 STS 是植物中合成芪类化合物的关键酶。迄今为止，研究者已从葡萄、花生、大黄、高粱、原始裸蕨属植物以及松树等植物中发现了芪合酶基因，这些基因的分离为研究芪类化合物生物合成的调控机制等奠定了重要基础。已克隆的STS基因可分为两种类型[8]，一种以反式香豆酰-CoA为特异性底物，称为白藜芦醇合酶（resveratrol synthase, RS），另一种以肉桂酰-CoA为特异性底物，称为赤松素合酶(pinosylvin synthase, PS)。葡萄、花生、大黄、高粱等被子植物中的芪合酶归为前一种类型RS，而存在于裸蕨属植物和松树等植物中的芪合酶归为后一种类型PS。  
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2 葡萄 STS 基因的克隆 

2.1 实验材料和仪器
2.1.1 实验材料 
（1）  植物材料 葡萄（Vitis vinifera L.）叶片，取自本实验室葡萄种植区。 
（2）  菌株和载体 菌株为 E.coli DH5α，载体为 pEASY-T1 Simple Cloning Vector。 

2.1.2 溶液的配制 
（1）DEPC 水：1L ddH2O 中加入 1mL DEPC 原液，配制 1‰ DEPC 水，搅拌混匀，在 37℃过夜后高压灭菌，4℃保存备用。 （2）50×TAE：Tris 242g，冰乙酸  57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100mL，加纯水定容至 1L。 （3）LB 培养基（100mL 体系）：在三角瓶中，分别加入胰蛋白胨(Tryptone)1g；酵母提取物(Yeast Extract)0.5g；NaCl 1g；加 ddH2O 定容到 100mL，，灭菌，4℃保存（固体的则还需加 1.5g 琼脂）。 （4）2×YT 培养基（100mL 体系）：在三角瓶中，分别加入胰蛋白胨(Tryptone)1.6g；酵母提取物(Yeast Extract)1g；NaCl 0.5g；加纯水定容至 100mL，高压灭菌，于 4℃保存备用。 （5）X-gal：将 20mg X-gal 加入到含 1mL DMF 溶液的 1.5mL Eppendorf tube 中，混匀，得到终浓度是 20mg/mL，-20℃避光保存。 （6）IPTG（200mg/mL）：在 1.5mL EP 管中加入 800μL 超纯水，并将 200mg 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入 EP 管中充分溶解，然后用 0.22?M 的滤膜对其进行过滤灭菌，-20℃保存备用。 
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2.2 实验方法

在NCBI-UniGene数据库中以stilbene synthase为关键词进行搜索，找到欧洲葡萄 STS 基因的 EST 序列，将结果中具有重叠部分的序列用 DNAMAN 软件进行比对、拼接、组合成较长的复合 EST 序列。使用 NCBI 中的ORF  Finder 和 CD  Search 工具预测拼接的复合 EST 序列是否具有完整的开放阅读框（ORF）、所编码的氨基酸序列是否具有 STS 保守结构域，从中选择具有完整 ORF 且编码的氨基酸具有 STS 保守结构域的序列，通过序列比对和基因组定位分析，去除部分重复的 STS 基因,  最终得到 6 个具有完整 ORF 的不同 STS 基因。根据基因组定位信息对得到的6个基因进行编号并依次命名为VvSTS1~VvSTS6。选择其中的VvSTS2和VvSTS6进行分子克隆。将回收产物与 pEASY-T1 Simple Cloning Vector 进行连接，连接反应体系（5μL）如下：PCR 回收产物 3μL，pEASY-T1 Simple Cloning Vector 1μL，灭菌水补足至总体积 5μL。反应条件：25℃，5min。反应结束后，将离心管置于冰上。 

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3  葡萄 STS 基因的生物信息学分析 ......... 16 
3.1  材料与方法 ...... 16 
3.1.1  材料 ....... 16 
3.1.2  方法 ....... 16 
3.2  结果与分析 ...... 17 
3.3  本章小结 .......... 26 
4  不同物种 STS 基因的分子进化研究 ..... 27 
4.1  材料与方法 ...... 27 
4.1.1  材料 ....... 27 
4.1.2  软件与方法 ......... 27 
4.2  结果与分析 ...... 27 
4.2.1 12 种不同植物 STS 基因密码子适应指数分析 ......... 27 
4.2.2  不同物种 STS 多序列比对和系统进化分析 ..... 28 
4.2.3  不同物种 STS 保守结构域分析 .... 30 
4.3  本章小结 .......... 34 
5  不同胁迫处理后葡萄 STS 基因的表达 ........ 35 
5.1  材料处理 .......... 35 
5.2  实验方法 .......... 35 
5.2.1  葡萄 RNA 的提取、纯化及 cDNA 的合成 ....... 35 
5.2.2  引物设计 ...... 35 
5.2.3  实时定量 PCR 检测 ......... 35 
5.3  实验结果 .......... 36
5.3.1  葡萄总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳检测 ........ 36 
5.3.2  实时定量 PCR 检测 ......... 36 
5.4  结果分析 .......... 38 

5 不同胁迫处理后葡萄 STS 基因的表达 

5.1 材料处理 
在三株葡萄树上，分别取 6 片大小相仿且基本完好无损伤的新鲜叶片，依据 VvSTS6基因启动子顺式作用元件分析结果，在常温下进行以下处理： （1）赤霉素（GA）处理：用 2mM  GA 溶液涂抹第一株葡萄的 5 个叶片，处理 0h（对照组）、6h、12h、24h、36h 和 48h 后取样。 （2）脱落酸（ABA）处理：用 2mM ABA 溶液涂抹第二株葡萄的 5 个叶片，处理0h（对照组）、6h、12h、24h、36h 和 48h 后取样。 （3）UV 辐射处理：用 UV 辐射第三株葡萄的 5 个叶片，处理 0h（对照组）、6h、12h、24h、36h 和 48h 后取样。 取样后将样品立即置于液氮中冷冻，于-80℃条件保存备用。本实验中分别采用 GA、ABA、UV 处理葡萄叶片，结果表明 VvSTS6 基因的表达量发生了不同程度的变化（图 5.2）。实时荧光定量 PCR 结果显示：葡萄叶片经过 GA 处理后，VvSTS6 的表达量在 0-24h 时期内显著增加，在 24h 时表达量达到峰值，是未处理组的 5 倍多，处理 36h 时出现下调表达，表达量下降到峰值的 1/2 左右，之后 VvSTS6的表达量继续下降，到处理 48h 时大约为 0h 时表达量的 2 倍（图 5.2A）。葡萄叶片经过 ABA 处理后，VvSTS6 基因表达量的变化呈现出与 GA 处理相同的趋势：先上升至峰值后下降。在处理 48h 时的基因表达量也为 0h 时表达量的 2 倍左右（图 5.2B）。葡萄叶片经 UV 辐射处理后，在 0-48h 时间段内表达量处于持续增加状态，在 0-24h，基因表达量迅速上升，24h 时积累量约为 0h 的 5.3 倍，之后表达量继续增加，只是上升趋势没有之前明显，48h 时表达量接近 0h 初始水平的 6 倍（图 5.2C）。 
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结    论

本课题以欧洲葡萄叶片作为研究材料，分离得到了葡萄 STS 基因家族中的一个成员VvSTS6，经测序鉴定及序列比对分析证实其确实是欧洲葡萄 STS 基因。 对从 NCBI-UniGene 数据库中查找到的序列进行比对拼接，得到六个不同的 VvSTS基因，对它们的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了相关生物信息学分析。结果表明葡萄 STS 家族蛋白具有相同的保守结构域 CHS-like；相似的理化性质、功能位点、二级结构和三级结构，其二级结构主要由 α 螺旋和随机卷曲组成；葡萄 STS 属于弱亲水性胞浆蛋白；葡萄 STS 基因能够响应多种胁迫信号通路；葡萄科植物 STS 具有不同程度的相似性，符合种属间亲缘关系。 查找与 VvSTS6 基因编码的氨基酸序列有较高相似性的其他物种 STS 氨基酸序列及其对应的基因编码区序列，对不同物种 STS 基因进行分子进化研究，结果表明不同植物中 STS 具有相对保守的结构；STS 在物种间的进化符合物种进化规律；STS 保守结构域的分析证实了物种进化关系稳定。 对葡萄叶片进行 GA、ABA、UV 辐射处理，采用实时荧光定量 PCR 法研究 VvSTS6的表达情况，结果显示 GA、ABA、UV 胁迫均能促进 VvSTS6 的表达，说明 VvSTS6 能响应这些胁迫信号通路，进而证实 STS 基因参与植物抵御逆境胁迫过程。 综上所述，本课题为深入研究葡萄 STS 基因提供了重要信息和理论依据，也为利用生物信息学方法深入研究其他基因家族提供了新思路。此外，本课题对进一步探究芪类化合物合成的分子机制、采用基因工程技术生产芪类化合物等也具有一定参考价值。  
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参考文献(略)

本文编号：54306