普通小麦脂肪氧化酶活性及其基因克隆与功能分析

发布时间：2016-06-12 06:41

第一章  文献综述

1  小麦籽粒脂肪氧化酶研究进展
小麦是我国主要粮食作物之一，长期以来，我国小麦育种以增加产量和提高抗病性为主要目标。近年来随着人们生活质量的提高，市场对优质小麦的需求量不断增加，小麦品质的遗传改良越来越受育种家的青睐，品质已成为小麦育种和生产的重要目标，也是影响产业竞争力的重要因素（何中虎等，2006 和 2011）。面粉颜色性状是评价小麦品质的重要指标之一，不仅对面制品的表观色泽有重要影响，而且对其营养价值也具有一定影响（He 等，2004），面粉或其面制品的色泽主要取决于面粉中黄色素、类胡萝卜素等色素类物质的积累（胡瑞波等，2006）。国内外研究表明，小麦籽粒中八氢番茄红素合成酶（Psy）（He 等，2009；Crawford等，2011）、多酚氧化酶（Ppo）（Baik 等，1995；Chang 等，2007）、脂肪氧化酶（Lox）（汪晓鸣等，2013；Borrelli 等，1999 和 2008）以及一些其它过氧化物酶通过对色素类物质的氧化降解，进而影响面粉或面制品的色泽、加工品质、磨粉品质、储藏特性等品质性状。 小麦籽粒中的Lox含量很低，但是其在酶促脂肪氧化过程中产生的活性氧不仅能降解色素类物质，影响面粉及馒头、面包和各种面条等面制品颜色（Mares等，2001），而且能影响小麦种子活力、储藏特性和面粉加工品质等（Pastore等，2000；郑文寅等，2009）。目前，国外在小麦脂肪氧化酶的生化机理、结构特征和分子生物学遗传分析以及与品质性状关系等方面已开展了大量的研究。因此，总结小麦籽粒脂肪氧化酶的测定方法及其遗传特征，并重点介绍小麦籽粒Lox活性基因分子生物学研究概况以及与品质性状的关系，为国内研究小麦籽粒Lox性状提供理论依据，旨在为我国小麦色泽品质的遗传改良提供参考（张福彦等，2014 a）。因此，通过遗传育种途径改良我国小麦品种色泽相关性状，了解小麦脂肪氧化酶基因对色泽的形成机制对改良我国小麦色泽品质具有重要现实意义与经济价值。
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1.1  脂肪氧化酶的发现
1932 年，Andre 和 Hou 首次在大豆中发现脂肪氧化酶（Lipoxygenase，EC  1.13.11.12，简称 Lox）的存在（Andre 和 Hou，1932）。1950 年，Irvine 和 Winkler 首次在小麦中研究发现脂肪氧化酶（Lipoxygenase，EC  1.13.11.12，简称 Lox）在面制品加工过程中对色素类物质的氧化降解作用（Irvine 和 Winkler，1950）。随后又研究了硬粒小麦中的脂肪氧化酶动力学特性（Irvine 和 Anderson，1953）。而 Hsieh 等（1984）利用 CM-纤维素柱层析的方法首次从硬粒小麦胚乳中分离出3 个有Lox 活性有关的同工酶，分别命名为lipoxygeanses-1（L-1）、lipoxygeanses-2（L-2）和 lipoxygeanses-3（L-3）。之后，Shiiba 等（1991）利用凝胶过滤和DEAE 离子交换层析法从小麦胚芽中也分离纯化出 L-1、L-2、L-3 这三种 Lox 同工酶。进一步研究认为 L-3 同工酶对小麦面包烘焙品质影响最大（Shiiba 等，1991）。之后，国外学者研究表明，脂肪氧化酶是一类不含血红素铁或锰的蛋白质，专门催化含有顺，顺-1，4-戊二 烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，生成具有共扼双键的多元不饱和脂肪酸氢过氧化物（Loiseau 等，2001），且在动物、植物及微生物中广泛存在（Brash 等，1999；Feussner 等，2002）。 
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2  脂肪酸氧化酶在其它物种中的研究进展

2.1  脂肪酸氧化酶在大麦中的研究概况
Yang 等（1993）发现大麦中只含有 2 种 Lox 同工酶，分别命名为 Lox-1 和 Lox-2，并利用 CHAP 色谱法从大麦麦芽中分离并纯化了 Lox-1 和 Lox-2 同工酶，进一步研究发现 2种同工酶的分子量非常相近，分别为 90 kDa 和 95 kDa，Lox-1 的最适 pH 为 5.2，而 Lox-2最适 pH 为 6.8，且 Lox-1 主要存在于成熟的种子中，而 Lox-2 主要是在灌浆期和种子萌发24 小时以后开始大量表达（Yang 等，1993）。van Mechelen 等（1995）利用 RT-PCR 和 RACE技术从大麦中克隆得到 3 个 Lox 全长 cDNA 序列，分别为 LoxA（L35931）、LoxB（L37359）和 LoxC（L37358），Southern 印迹杂交结果表明 LoxA、LoxB 和 LoxC 在大麦基因组中也属于单拷贝克隆。Lox-1 和 Lox-2 分别由 LoxA 和 LoxC 基因编码，同时利用 AFLP 标记将 LoxA和 LoxB 定位于大麦第 4 号染色体上，且两者的遗传距离仅为 1.0 cM，而 LoxC 则被定位于大麦第 7 号染色体上（van Mechelen 等，1999）。Hirota 等（2005）在大麦中发现 6 个 Lox-1缺失的突变体，免疫分析表明发生这些突变的大麦中 Lox-1 蛋白缺失，利用其构建的 F2群体进行遗传分析，结果表明该突变是由位于 4H 染色体上 LoxA 一个隐形基因控制，在其结构基因区域上，发现 6 个突变体有类似的特征特性和独特的多态性，推测认为这些突变类型可能起源于同一祖先（Hirota 等，2005）。 
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2.2  脂肪酸氧化酶在大豆中的研究概况
Theorell 等（1947）利用离子交换层析的方法首次从大豆种子中获得了 Lox-1 结晶，之后，采用层析法在处于萌发期的大豆籽粒中先后发现并分离出 Lox-2、Lox-3、Lox-4、Lox-5和 Lox-6 等 5 种脂肪氧化酶的同工酶（Christoper 等，1970，1972；Kato 等，1992）。Kato等（1992）将先后分离的 Lox-4、Lox-5 和 Lox-6 同工酶与先前研究发现的 Lox-1、Lox-2、Lox-3 的氨基酸序列进行分析，结果表明 Lox-4 与 Lox -1、Lox-2、Lox-3 存在部分同源，但它们之间序列及结构特征又显著不同。大豆种子中的 Lox-1、Lox-2、Lox-3 分别受 Lx1、Lx2和 Lx3 基因控制，其中 Lx1 基因和 Lx2 基因是二者紧密连锁，共同控制 Lox 活性性状，而Lx3 基因则可以独立遗传，，单独对 Lox 活性产生影响，且脂肪氧化酶的酶促反应与大豆蛋白制品产生的挥发性气味和豆腥味的关系非常密切（Kitamura 等，1985）。利用 RNAi 技术抑制大豆中Lox 基因表达，发现已稳定遗传至 T3代的大豆转基因植株中，其籽粒脂肪氧化酶活性及含量显著降低（马建等，2009）。Shibata 等（1988）对大豆种子中 L-1、L-2 和 L-3同工酶结构进行分析，结果表明 Lox 蛋白中存在 2 个相对比较保守的结构域，即：α-螺旋结构和 β-桶状结构，其中 α-螺旋结构是在 C 末端有一段 40 个氨基酸组成的保守区域，其中包含 6 个组氨酸和 2 个酪氨酸，主要具有调节酶的活性的功能。而 β-桶状结构与 Ca2+、脂类物质的结合、主要是与酶活性激活、膜的转运以及维持蛋白质结构的稳定性有关（Brash 等，1999）。 
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3  植物 RNA 干扰研究进展 ...... 12
3.1 RNA 干扰的发现 ......... 13 
3.2  植物 RNA 干扰机理及其特点 ....... 13 
3.3  植物 hpRNA 表达载体的构建 ....... 15 
3.3.1  启动子和终止子的选择 ....... 15 
3.3.2  内含子及其它调控序列 ....... 15 
3.3.3 hpRNA 表达载体的构建方法 ........ 15 
3.4 RNA 干扰的诱导方法 ........... 16 
3.5  植物 RNA 干扰在植物中的应用 ............. 16 
4  本研究目的和意义 ....... 18 

3  讨论 

3.1 RNAi 载体的构建策略 

要将外源目的基因导入受体植物中，使之表达并获得稳定遗传的转基因植株，必须借助合适的植物表达载体以及相应的基因表达调控元件来实现，然而 RNAi 表达载体的构建在其理论上和技术上都相当复杂，其干扰片段的选择、大小以及在靶基因中的位置等诸多因素，不但会影响 RNAi 的遗传转化效率，而且会影响外源基因在转基因植物中的表达效率和遗传稳定性（Wianny 等，2000；Holen 等，2003；Lee 等，2011）。 RNAi 表达载体构建过程中基因的表达调控原件的选择对于构建表达载体的成功与否至关重要，如：启动子、终止子、筛选标记、O 序列和 poly（A）等一些调控原件，其中启动子的选择是决定导入的目的基因在受体植物中表达的重要因素之一。此外，构建表达载体将启动子区域进行加倍，不同启动子串联等方法会对启动子的转录活性产生一定的影响。本研究选用中间载体 pSAA003 为 RNAi 表达载体提供 O 序列和 poly（A）序列，pSAA004 植物表达载体提供 RNAi 表达载体所需的 Ubiquitin 启动子、Nos 终止子以及 Bar 基因筛选标记。Wesley 等（2001）研究认为，植物双链中的发夹结构 RNA（hpRNA）的长度在 98-853  bp的目的基因反向重复片段均能够高效地引发干扰效应，且不会导致植物细胞死亡。前人研究RNAi 沉默发现在干扰片段内包含目的基因的保守区域时，则有可能同时沉默一簇基因，但其沉默效率和特异性降低，若选择非保守区域（一般为功能基因的编码区）为干扰片段时就会大大提高单个基因的沉默效率和特异性（Wianny 等，2000）。 

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结论

1.  来自河南、河北、山东等黄淮海地区的 163 份不同遗传背景的普通小麦冬品种（系）的 Lox 活性分布范围为 49.13-110.77 A234 min?1g?1，说明黄淮海麦区小麦品种（系）间 Lox活性存在较大差异，变异范围较为广泛，具有较大的选择潜力。Lox 活性基因型与环境互作的方差分析表明，参试品种（系）的籽粒 Lox 活性在基因型、年份、地点、重复间、基因型与年份、基因型与地点、年份与地点以及基因型、年份、地点三者之间的差异均达到极显著水平，其中小麦籽粒 Lox 活性基因型效应最大，其顺序依次为：基因型效应>基因型与年份互作效应>基因型与地点互作效应>年份效应>基因型、年份、地点三者互作效应>年份与地点互作效应>地点效应>重复效应。此外，小麦籽粒 Lox 活性的广义遗传力为 0.75，也间接说明小麦籽粒 Lox 活性很大程度上受遗传控制。 
2.  对参试品种（系）的 Lox 活性、蛋白质含量、稳定时间、籽粒硬度、白度（L*）、红度（a*）、黄度（b*）、湿面筋含量以及沉降值等品质性状进行分析表明，Lox 活性、蛋白质含量等 9 个品质性状的品种（系）间的差异均达到极显著水平，小麦籽粒 Lox 活性与面粉白度（L*）和面粉红度（a*）呈显著负相关，而与面粉黄度（b*）呈显著正相关，但是与蛋白质含量、籽粒硬度、湿面筋含量、面团稳定时间以及沉降值等品质性状的相关性很小。蛋白质含量与湿面筋、沉降值、面粉红度（a*）呈极显著正相关，其中与湿面筋含量的相关系数高达 0.915，与面粉白度（L*）呈显著负相关。面粉白度（L*）与其它 8 个品质性状均呈显著或极显著负相关；而面粉白度（L*）与面粉黄度（b*）的之间呈极显著负相关，从而说明小麦籽粒 Lox 活性与面粉色泽的关系更为密切。这些对了解小麦籽粒 Lox 活性与面粉色泽及蛋白质含量等品质性状的关系具有一定的参考价值。 
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参考文献(略)

本文编号：56317