玉米骨干自交系体细胞胚胎发生相关基因的表达及蛋白质组学研究

发布时间：2016-06-14 07:29

第一章 文献综述

由于植物细胞具有全能性，理论上来说，在一定环境条件下，植物任何组织部位的体细胞都可以诱导成为胚性细胞。但在体细胞胚胎诱导过程中，以不同物种或同一物种的不同器官为外植体，诱导体细胞胚胎的结果是大不相同的。胡萝卜的胚、下胚轴、幼根、主根、叶柄、花序轴组织以及原生质体等均可诱导形成体细胞胚胎；但荔枝仅以幼胚和茎尖为外植体，才能诱导形成体细胞胚胎[39]；棉花可诱导体细胞胚胎的外植体以下胚轴为最佳，其次为子叶[40]；尽管人们以玉米的幼胚、成熟胚、花药、幼苗切段、幼苗叶基部、幼苗基部叶片、幼胚的芽顶分生组织、雌雄幼穗、雄幼穗颖片、未成熟花序、幼苗芽顶分生组织及中胚轴、节间芽组织、茎节切段等为外植体进行了愈伤组织的诱导及植株再生的分化[41,42,43,44,45,46,47]，结果表明玉米以授粉后 12-15 天的幼胚为外植体，获得体细胞胚胎的可能性最大。因为不同物种和不同组织器官对外界刺激的反应能力存在差异，所以不同外植体诱导体细胞胚胎发生的难易程度也存在差异。

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第二章 玉米体细胞胚胎发生和形态建成的组织学研究

2.1 实验材料

以玉米骨干自交系 Y423 为材料。对其进行体细胞胚胎诱导，组织学研究的材料为组织培养过程获得的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织和体细胞胚胎等。为了确保材料能全面覆盖再生过程中主要类型的愈伤组织，组织培养材料各培养 3 批，批次间隔为一个月。

2.2 实验方法

对授粉后 12-15d 的玉米幼胚（大小为 1.5-2.5mm）进行取材，田间取整穗，在实验室无菌条件下剥除苞叶，玉米籽粒于 75%酒精表面消毒 3 次，待酒精挥发后，使用无菌刀挑取幼胚，胚盾片向上接种于诱导培养基中，平均每皿 30 粒左右，于 24℃暗培养。培养 20-25d，剔除小芽，将诱导出的愈伤组织转移至继代培养基中，于24℃散光培养，每20d继代一次，继代3-4次后，胚性愈伤组织大量出现。再进一步继代，获得体细胞胚胎（本实验室专利，玉米体细胞胚胎的诱导方法，ZL 2011 1 0024436.0）。将体细胞胚胎转移至分化培养基中，于24℃，光培养 12h，光照强度为 7500lux，暗培养 8h。5-7d 左右，体细胞胚胎会出现绿芽点，20-30d左右，同时长根长芽，40d左右成苗。实验所需培养基如表2-1。

第三章 玉米体细胞胚胎发生相关基因表达分析.........27

3.1 实验材料 ........................27

3.2 实验方法 ...................27 

3.3 结果与分析 .........39 

3.4 讨论 ...............53

3.5 结论 ..............55

第四章 体细胞胚胎相关基因的克隆及分析.........57

4.1 实验材料 .................57

4.2 实验方法 ..............57 

4.3 结果与分析 ............59 

4.4 讨论 .......68

4.5 结论 ...................69

第五章 玉米体细胞胚胎蛋白质组分析 ...71

5.1 实验材料 .........71

5.2 实验方法 ............71 5.3 结果与分析 .................75 

5.4 讨论 ....................94

5.5 结论 ........96

第五章 玉米体细胞胚胎蛋白质组分析

5.1 实验材料

玉米骨干自交系 Y423 的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。

5.2 实验方法

（1）蛋白提取液（10%TCA/丙酮溶液）：TCA 晶体 5g；丙酮溶液 50ml 充分混匀，用时加入 β-巯基乙醇 35μl。（2）PMSF（苯甲基磺酰氟）溶液（100mM）：加 PMSF 17.42mg 溶于 1ml异丙醇。（3）蛋白裂解液：尿素 10g；硫脲 3.8g；4% CHAPS (w/v) 1g；ddH2O 定容到 25ml，用时加入 100 mM PMSF 10 μl。（4）蛋白溶解液：加 SDS10mg；TEAB buffer 5ml；ddH2O 5ml；混匀。（1）称取约为 1g 样品，于不断加有液氮的冷研钵中研磨至粉末状,同时加0.1g PVPP（cross-linking polyvinylpyrrolidone，交联聚乙烯吡咯烷酮）；（2）将研磨后的样品等量分装于预冷的 1.5ml 离心管中，加入 3-4 倍体积的蛋白提取液，混匀后于-20 C 沉淀 2h；（3）4 C，35000 g 离心 30 min，弃上清，向沉淀中加入 3-4 倍体积的含有0.07%（v/v）β-巯基乙醇的冷丙酮，混匀后于-20 C 沉淀 1h；（4）重复步骤 3，直至沉淀为白色；（5）4 C，35000 g 离心 30 min，弃上清，通过真空离心干燥获得蛋白粉末；（6）称取 20mg 蛋白粉，加入 80μl 蛋白裂解液，混匀后再分别加入 10 μl100 mM PMSF，和终浓度为 2mM 的 EDTA，冰山超声 5min 助溶后，添加终浓度10mM的DTT，继续超声15min，超声条件：功率200W，超声2s，间歇3s；（7）4 C 25000 g 离心 20 min，取上清；（8）上清液在 56 C 条件下加入终浓度 10 mM DTT 处理 1 小时，还原打开二硫键；（9）立刻加入终浓度 55 mM IAM 暗室静置 45min，进行半胱氨酸的烷基化封闭；（10）加入 4-5 倍体积于样品溶液的预冷丙酮，，-20 C 沉淀 2 h；（11）4 C 25000 g 离心 20 min，弃上清；（12）加入200μl 蛋白溶解液，超声溶解15min，4 C 25000 g离心20 min，取上清用于定量。
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第六章

（1）对玉米骨干自交系 Y423 诱导获得的体细胞胚胎进行石蜡切片和扫描电镜观察，从组织学上确定了玉米体细胞胚胎发生的 5 个阶段：原胚、球形胚、梨形胚、盾片胚、成熟胚，模拟合子胚的发育过程。（2）采用 cDNA-AFLP 技术，从转录组水平对玉米胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织进行研究，共获得条带数为6583个，差异表达片段为2297个，以非胚性愈伤组织为对照，在胚性愈伤组织中呈上调表达的条带为 1023 个，而呈下调表达的条带数为 1274 个。经回收、测序、比对，最后获得 117 个可能促进体细胞胚胎发生的基因片段。（3）成功克隆获得了 2 个与体细胞胚胎发生相关的未知基因，分别命名ZmSUF4 和 ZmDRP3A，CDS 序列大小分别为 1080bp 和 2466bp。这两个基因都与高粱、谷子和水稻同源性较近。（4）采用 iTRAQ 技术，从蛋白质组水平对玉米胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织进行研究，共鉴定到蛋白数为 5592 个，差异表达蛋白数为 632 个，以非胚性愈伤组织为对照，在胚性愈伤组织中上调表达的蛋白数为 366 个，下调表达的蛋白数为 266 个。

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参考文献（略）

本文编号：57031