花生种子不同发育时期的表达谱及DGAT基因的表达分析
第一章 文献综述
1.1 花生概括
花生,属蝶形花科,为一年生低矮草本植物,原名落花生(Arachis hypogaea),种子也叫花生米,美名长生果。花生是世界范围内重要的油料作物之一,中国的花生种植面积为世界第二,年产量则是世界第一位,其经济价值以及营养价值都非常高,花生的籽仁中含有大量的脂肪、蛋白质以及各类维生素等,被称为“植物肉”。花生蛋白是一种营养价值很高的植物蛋白,它含有人们必需的 8 类氨基酸,易被消化、吸收;花生比大豆含有更少的抗营养因子,,被认为是极有发展潜力的乳糖不耐症患者的蛋白基料与牛乳等的替代品,尤其是花生中含有丰富的维生素 E,具有延缓人体衰老和增强人体免疫力等作用[1,2]。花生油主要成分包括饱和脂肪酸(20%)和不饱和脂肪酸(80%),其中大量的不饱和脂肪酸亚油酸能够分解人体内的胆固醇并使其分解产物排出体外,避免胆固醇的沉积,从而起到降低胆固醇含量的功效,调节人体生理机能,对生长和发育起到促进作用[3],同时,花生油具有气味清香,营养丰富,滋味纯正的特点,是煎炸食品和烹饪的优良油脂,被誉为是中国的“橄榄油”,有“东方第一油”的美誉,深受群众喜爱。多年来,花生油绝对消费量呈稳中上升趋势。 据统计,在国内作物当中,花生种植规模已经位居第七位,而其农业产值则上升到了第五位,与油菜、向日葵、芝麻等油料作物相比,花生的总产、单产、出口量以及产值自 2000 年以来稳居世界第一[4,5],虽然我国花生的生产、出口以及加工形式良好,但目前花生的主推栽培品种老化以及退化严重,品种专用性不突出、遗传背景狭窄、优异种质资源匮乏[4,6],同时,花生产量、品质和抗性方面凸现的问题也使常规育种技术捉襟见肘,例如,对于榨油原料来说,影响其油供给能力与油脂加工等效益的重要指标就是种子含油量,研究表明,若榨油原料的含油量提升一个百分点,则油脂加工纯利润能够提高 7%[7]。而常规育种技术手段已经很难再进一步提升花生含油量。随着分子生物学技术的不断完善,人们已经分离克隆了大量的植物功能基因,并阐明其表达调控方式与分子机制,这为花生分子育种提供了可靠的参考,能够克服当今花生育种中存在的难题。
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1.2 花生油脂代谢机制研究
当前,花生油脂代谢机制研究主要集中于花生脂肪酸成分的改良以及高油酸形成过程的分子机理研究。有科研人员从栽培花生中分离两个油酰-磷脂酰胆碱Δ12 去饱和酶基因,AhFAD2A 与AhFAD2B,Northern 分析表明:这两种同源基因在普通的花生中均有表达,并且证明只有当 AhFAD2A和 AhFAD2B 基因发生突变而表达量显著降低的情况下,方能导致高油酸突变[8, 9]。Yin 等研究显示,FAD2 基因表达水平的降低直接导致其油酸含量从 37%上升到了 70%[10, 11]。禹山林等对辐射育种的高油酸花生品系(O/L 比值约 40)和普通花生品系中的Δ12 脂肪酸脱氢酶基因的序列进行了比较,并对两个基因编码区序列进行分析,结果发现突变的 AhFAD2B 基因序列有碱基 A 的插入,位置在起始密码子后第 442bp 处,这导致了编码区的提前终止而丢失了一个膜结合蛋白保守的组氨酸框[12]。转录水平的表达分析显示,其在普通花生中的表达量明显高于高油酸花生中的表达量[13]。另外,禹山林等通过克隆获得了五个花生 PEPC 基因,并证明其在普通花生和高油分花生品种的四种不同组织(根、茎、叶和种子)有差异表达[14]。周丽侠等人在对鲁花 14 等 13 个花生品种的Δ12 脂肪酸脱氢酶 AhFAD2 基因编码区进行序列分析研究时发现,该基因在 13 个花生品种中均存在 3 类转录本,即 AhFAD2A、AhFAD2B 与假基因[15]。早在上世纪 30 年代时,人们就已经开始对花生种子贮藏蛋白进行研究,人们根据不同基因型的种子蛋白 SDS-PAGE 的图谱,将花生球蛋白的组成模式分成 4个类型,通过分析蛋白的氨基酸组成,发现花生含有 17 种氨基酸,其中天冬氨酸含量很高,而甲硫氨酸和色氨酸含量较少。通过分析贮藏蛋白的积累模式和基因家族表达模式,可以筛选高甲硫氨酸蛋白品种[16]。
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第二章 花生种子不同发育时期的转录组测序及表达谱分析
花生的基因组(约为 2800Mb)要远远大于水稻的基因组(425Mb)和拟南芥的基因组(128Mb),并且栽培花生是异源四倍体作物且高度自交,其基因组结构十分复杂,这进一步加大了科研人员在分子层面上对其进行研究分析的难度。因此,在不能够全面获取栽培花生基因组信息的情况下,可以通过转录组来了解基因组的功能并揭示相关细胞组织的分子组成,为在分子层面上深入研究花生含油量和脂肪酸形成机制起到积极的促进作用,本实验选取遗传背景相同的高油、低油两个极端花生新品系,分别构建油脂累积的两个关键时期的转录组测序文库,利用 Solexa 高通量测序技术,全面获得花生种子特定发育时期的基因序列,并研究两个基因型在油脂积累关键时期的基因功能和基因结构差异,发掘与高油形成相关的调控基因。
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
实验材料为河南农业大学花生新品系花 12 和花 606,都是普通型,籽仁大多为椭圆形,连续开花习性,株型直立,其中花 12 含油量为 49.6%,花 606 含油量为 57.81%。
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2.2 结果与分析
采用 Yin 等(2011)方法提取花生种子的总 RNA,琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图 1,结果表明,RNA 条带清晰,没有拖尾,提取的总 RNA 质量很好,比较完整。经过分光光度计检测,OD260/280均在 1.8-2.0 之间,表明总 RNA 样品的纯度比较好。OD260/230 值在 2.0-2.2 之间,表明提取的 RNA样品较为纯净,没有污染。各品种的 RNA 样品 28S:18S 值均为 2.0,表示所提取的 RNA 样品完整性很好,没有发生明显降解:将构建好的花 U606 种子发育两个关键时期(30DAF 和 50DAF)和花 U12 种子发育两个关键时期(30DAF 和 50DAF)的转录组测序文库,运用 Illumina HiSeqTM 2000 平台开展测序,测序得到的原始图像通过 base calling 转化为 Raw reads 序列数据。过滤掉含有 adaptor、N 的比例大于 5%和低质量 reads 后,总共得到了 53924092 个 reads 的片段,包含有 4853168280 个核苷酸的序列信息,其中序列片段的长度大于 20 个碱基的百分比为 98%以上,GC%值平均为 47.73%,说明这 4 个转录组的序列测定结果都很好,能够为后续的数据组装工作提供准确的原始数据.
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第三章 DGAT 基因的序列分析及表达研究 ......... 28
3.1 材料与方法 ....... 28
3.1.1 材料 ........ 28
3.1.2 方法 ........ 28
3.1.2.1 花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因的获得 ....... 28
3.1.2.2 生物信息学分析 ..... 29
3.1.2.3 总 RNA 的提取 ...... 29
3.1.2.4 引物设计与合成 .... 29
3.1.2.5 反转录合成 cDNA ........ 30
3.1.2.6 花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因在种子 ......... 30
3.2 结果与分析 ....... 31
3.2.1 二酰甘油酰基转移酶(DGAT)序列的获得 ..... 31
3.2.2 对花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)进行生物信息学分析 ....... 32
3.2.2.1 花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)蛋白序列分析 ........ 32
3.2.2.2 二酰甘油酰基转移酶(DGAT)序列比对 .......... 32
3.2.2.3 二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因系统进化树构建 .... 36
3.2.3 花生 DGAT 基因在种子发育过程中的表达分析 ...... 37
3.3 讨论 ..... 39
第三章 DGAT 基因的序列分析及表达研究
二酰甘油酰基转移酶(DGAT)催化三酰甘油(TAG)合成途径即 Kennedy 途径的最后一步,是该途径唯一的限速酶,其活性位置主要位于内质网。作为 Kennedy 途径中最关键的限速酶,二酰甘油酰基转移酶(DGAT)在生物体内的三酰甘油(TAG)合成过程中起着十分重要的作用,有研究表明,在油料种子发育过程中,油脂快速积累的同时二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的活性也逐渐增强,随着油脂含量逐步稳定,二酰甘油酰基转移酶(DGAT)活性也逐渐降低。目前科研人员已经对花生中的二 酰甘油酰基转移酶(DGAT)有了一定的研究,如迟晓元等人成功从花生中分离克隆出了 DGAT1 和DGAT3 基因,王龙龙等人通过研究发现,DGAT1、DGAT2 以及 DGAT3 在花生种子发育过程中均有表达,但在不同的时期表达量均不相同,推测这三种花生 DGAT 基因可能在种子发育的不同时期起主要作用,共同完成花生种子储存脂类 TAG 的积累。 为探明二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因在花生种子发育期间对油脂积累的调控机制,本研究通过对转录组测序得到的 5 条花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因序列进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量 PCR 对花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因在高油份含量花生花 606 和低油份含量花 12 两个品种种子不同发育阶段的表达进行分析,为进一步研究花生二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因的生物学功能奠定基础。
.........结论
为了揭示在花生种子油脂合成调控过程中相关基因的动态变化,本研究以高油、低油两个花生品系的油脂合成初期和高峰期材料为研究对象,采用 Solexa 的高通量测序技术测序,成功构建了花生籽仁早期和中后期 4 个转录组测序文库,通过分析发现数据库中包含了大量的花生种子中调控生化代谢的基因,其中有与油脂合成相关的基因,如脂肪酸合成的调控基因,亚油酸和亚麻酸合成的调控基因等。此外,将两个数据库的数据进行比对分析后,也发现了上述相关基因的表达量的变化情况,并且在代谢网络中对各个基因进行了调控定位。依据代谢通路可以将转录组中的数据分成 126 类,有生化代谢通路,植物一真菌互作,DNA 剪切,植物激素信号传导,苯丙氨酸生物合成,萜类化合物与类固醇类化合物合成,脂类代谢和 RNA降解等,其中,涉及生化代谢的基因数量最多,达到了 7672 条,占整体的 32.95%;其次是植物激素信号传导的基因有 1493 条,占整体的 6.41%;其中有 4 大类代谢与油脂相关,分别是脂肪酸代谢途径,涉及的基因有 145 条,占整体的 0.62%;脂肪酸生物合成途径,涉及的基因有 85 条,占整体的 0.7%;不饱和脂肪酸的生物合成,涉及的基因有 116 条,占整体的 0.5%;亚麻酸生化代谢,涉及的基因有 138 条,占整体的 0.59%; 对这些差异表达基因按照代谢途径归类,一共得到了 120 多种代谢途径的信息,其中有 5 种代谢途径与油脂合成调控联系紧密:不饱和脂肪的生物合成,亚油酸的新陈代谢,亚麻酸的新陈代谢,脂肪酸的生物合成和脂肪酸的新陈代谢。
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参考文献(略)
本文编号:59658
本文链接:https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/59658.html