猕猴桃肌醇代谢对抗逆性和抗坏血酸形成的影响

发布时间：2016-06-21 06:41

第一章 文献综述

有许多研究表明了 MI 的含量和多种疾病相关，例如糖尿病以及糖尿病所引起的肾病、神经病和视网膜病等（Bry 和 Hallman 1991；Pfeifer 和 Schumer 1995；Raccahet al. 1998）。研究显示 MIOX 可能在这些疾病中发挥作用（Arner et al. 2001）。MIOX 是MI 降解途径的关键酶，这也就为 MI 的作用提供了证据。另一个证据可以从 PtdIns 的研究中获得，和植物中同样重要的是 PtdIns 在细胞膜中的功能，它是细胞膜磷脂双分子层的重要组分，具有不可或缺的作用。PIP2在信号转导、细胞移动性以及胞吐作用中具有重要作用（Di Paolo 和 De Camilli 2006；Heck et al. 2007）；PtdIns3P 和 PtdIns（3，5）P2参与细胞内运输途径；PtdIns（3，4，5）P3可作为原生质体膜的信号（Michell 2008）。显而易见相对于植物，动物中 PtdIns 的研究更为深入，PtdIns 的代谢正逐渐成为研究者对许多疾病进行探讨的主题。研究显示，磷脂酰肌醇 4 激酶（PI4K）介导 PtdIns 生成磷脂酰肌醇 4-磷酸（PI4P）具有多个同工酶，其功能的障碍，能够引起精神疾病和神经性的疾病（Clayton et al. 2013）。PIP5K 催化 PI4P 生成 PIP2，对小鼠的研究表明类型一的PIP5K（PIP5K1C）能够调节依赖于 PIP2的疼痛信号的转导，或许是治疗慢性疼痛的一个目标（Wright et al. 2014）。另有研究表明 PIP2在人免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ）的感染中也起重要作用（Rocha-Perugini et al. 2014）。

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第二章 猕猴桃肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶基因克隆及表达分析

2.1 材料、试剂和仪器

干旱和盐处理采用的材料：干旱和盐处理均选取 2 年生美味猕猴桃‘秦美’（Actinidiadeliciosa cv. Qin Mei）幼苗，栽入花盆时进行称重，确保每盆的质量一致。每盆栽 1 株，每个取样时期 5 株作为一个重复，共重复 3 次。不同种猕猴桃 MIPS 的比较分析以及 MIOX 分析采用的材料：2012 年于西北农林科技大学园艺训练场 9 年生猕猴桃树上取样，共 4 个种，美味猕猴桃‘秦美’（Actinidiadeliciosa cv. Qin Mei）、软枣猕猴桃（Actinidia arguta）、毛花猕猴桃（Actinidia eriantha）、山梨猕猴桃（Actinidia rufa），花后每隔 7 或 15 天取样，在果实成熟期同时采取茎尖、幼叶、成熟叶、韧皮部、叶柄等组织，所有样品于液氮中速冻，存于-80℃待用。将至少 10 个果实（其它组织样品）作为一个重复，共重复 3 次。亚细胞定位用洋葱购于市场，拟南芥植株为本实验室保存。

2.2 试验方法

测序结果与 NCBI 上的 MIPS 基因序列进行比对，并采用生物信息学软件 DNAstar、DNAman 对目的序列进行分析；通过 Expasy 网站（）上的生物学软件对目的序列的理化性质（ProtParam）、二级结构（GOR）、三维结构（SWISS MODEL）和亲水性（ProtScale）进行预测和分析。对目的序列及其他生物中的 MIPS 氨基酸序列利用 Mega 5.0（Tamura et al. 2011）进行进化树的构建及分析。基因枪法转化洋葱表皮参考（Klein et al. 1987）的方法，拟南芥原生质体定位参考（Yoo et al. 2007）的方法。pA7 载体酶切位点选择 SalⅠ和 SpeⅠ。2.2.1.10 MIPS 在美味猕猴桃果实不同发育期和不同组织的表达分析采用上述方法提取 RNA 后，对不同的 RNA 进行反转录。取 1μg RNA, 采用PrimeScript RT reagent Kit（Takara）试剂盒。反转录产物用双蒸水稀释到 150 ng/μl。实时定量表达分析的引物采用 Primer Premier，version 5.0，software（Palo Alto，CA）设计。

第三章 猕猴桃 MIPS 基因干扰对抗坏血酸形成、植株形态和抗逆性的影响......48

3.1 材料、试剂和仪器........... 48

3.2 试验方法................. 49

3.3 结果与分析................. 53

3.4 小结........................ 75

第四章 讨论...................................76

4.1 猕猴桃 MIPS 的高度保守性........................ 76

4.2 幼果期是猕猴桃肌醇积累的主要时期................. 76

4.3 猕猴桃 MIPS 受非生物逆境的调控......... 77

4.4 猕猴桃 MIPS 在各组织中分布的普遍性......... 78

4.5 降低猕猴桃肌醇含量对抗坏血酸含量和抗逆性的影响........... 79

第五章 结论和主要创新点..........81

第四章 讨论

4.1 猕猴桃 MIPS 的高度保守性

肌醇-1-磷酸合酶在细菌、动物和植物中具有高度的保守性（Johnson 和 Sussex1995；Majumder et al. 1997；Chun et al. 2003；Abreu 和 Arag o 2007；Wongkaew et al.2010）。不同生物的 MIPS 序列相似度很高，都具有 4 个独特的保守氨基酸序列：“GWGGNNG”、“LWTANTER”、“NGSPQNTFVPGL”以及“SYNHLGNNDG”。这 4 个序列被认为对底物结合具有重要作用，可能预示着在进化过程中 MIPS 具有催化活性的中心结构是保守的（Majumder et al. 1997）。我们在猕猴桃 MIPS 氨基酸序列中发现了这4 个保守的区段。分析结果也显示出猕猴桃 MIPS 氨基酸序列和其它物种 MIPS 序列的高度相似性，表明猕猴桃 MIPS 同样是一个进化上高度保守的蛋白。构建的进化树显示，猕猴桃属的 MIPS 蛋白很明显的聚集在一个分枝，并同其他物种的分枝相区别。中华和美味猕猴桃并没有在同一分枝，反而和软枣猕猴桃的分枝更接近。一些研究者认为美味猕猴桃是中华猕猴桃的一个变种，而另一些研究者认为它们是独立的种。对同工酶和核 DNARFLP 的分析得出的结论则是美味猕猴桃是异源六倍体，它的一个亲本和中华猕猴桃关系很亲近（Liang 和 Ferguson 1984；Testolin 和 Ferguson1997；Mertten et al. 2012）。因为猕猴桃的起源和多倍性具有复杂性，单纯的分析 MIPS蛋白还是很有局限性。因此分析美味和中华猕猴桃的分歧，仍需要对更多的的猕猴桃种，更大的基因库进行研究。

4.2 幼果期是猕猴桃肌醇积累的主要时期

虽然我们试验中所检测的 4 种猕猴桃 MIPS 基因表达和酶活性存在少量差异，但是这两个值都在花后 0-15 d 达到最大值，这个时间普遍比 MI 积累的高峰期略早。这些结果预示着 MI 在果实幼果期达到最高水平，这与前人的一些结果相一致（Klages et al.1998；Boldingh et al. 2000；Lorence et al. 2004）。对 MIPS 的基因表达和酶活性测定进一步支持这一结论。作为 MI 合成途径的关键酶，MIPS 的转录水平和酶活性对 MI 含量具有至关重要的作用。因此 MIPS 基因表达和酶活性在果实发育早期就出现高峰很有可能为这一时期猕猴桃中高的 MI 含量提供基础。
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第五章 结论和主要创新点

1. 从美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）、毛花猕猴桃（Actinidia eriantha）、山梨猕猴桃（Actinidia rufa）和软枣猕猴桃（Actinidia arguta）中克隆获得 MIPS 基因序列。它们的最大开放阅读框均为 1533 bp，编码 510 个氨基酸，，序列比对显示出高达 98.94%的相似性。实时定量 PCR 分析表明，MIPS 基因表达在猕猴桃 4 个种（美味、毛花、山梨、软枣）中存在普遍性，并且在果实发育的幼果期 MIPS 的表达量和酶活性都最高。2. 检测了果实发育期 4 种猕猴桃（美味、毛花、山梨、软枣）可溶性糖含量（MI、蔗糖、葡萄糖、果糖）的变化。结果表明，MI 含量在美味、毛花和山梨猕猴桃中一直低于其他 3 种糖的含量，而在软枣猕猴桃中，MI 的含量在幼果期最高，可达到其他糖类平均值的 6 倍，说明 MI 是软枣猕猴桃幼果期的主要糖类。软枣猕猴桃 MI/蔗糖和 MI/（葡萄糖+果糖）的值都高于其它种猕猴桃，这可能是由于其具有较高的从其他糖转化到 MI 的效率。

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参考文献（略）

本文编号：59665