曝气生物滤池中环丙沙星去除行为及其对降解菌群抗药性的诱导作用

发布时间：2016-06-26 21:30

第一章 绪论  

1.1  氟喹诺酮类抗生素（FQs） 
FQs 是一大类人工合成的抗生素药物，具有抗菌活性强、组织渗透性高、交叉耐药性弱等特点，被广泛应用于泌尿生殖系统和下呼吸道系统等细菌感染疾病的治疗。从 20 世纪 80 年代开始至今，FQs 药物已经发展到第四代，包括诺氟沙星(NOR)、环丙沙星（CIP）、克林沙星（CLI）、加替沙星(GAT)等。其中，环丙沙星是目前广泛应用的 FQs 中抗菌活性最强者，其抗菌活性均较依诺沙星及诺氟沙星强 2~4 倍。 FQs 的基本结构为  4-氟喹诺酮酸，在其喹诺酮环上均含有氟原子，其结构骨架如图 1-1 所示[1]。C-3 上的羧酸和 C-4 上的吡啶酮是 FQs 的主要官能团，主要与细菌细胞 DNA 促旋酶结合，从而抑制细胞 DNA 复制；C-6 上的氟原子能够加强喹诺酮分子与 DNA 促旋酶的结合，增强喹诺酮对细胞组织的渗透力。N-1上的取代基主要影响 FQs 的抗菌谱；当 R2取代基为哌嗪环时，FQs 就同时含有碱性基团哌嗪基和酸性基团羧基，属于两性化合物。大部分 FQs 不溶于石油醚、四氯化碳和氯仿，能溶于甲醇、氰甲烷、乙腈，难溶于水，易溶于冰醋酸，稀酸性和稀碱性溶液。通常情况下，温度、pH 和光照对大部分 FQs 的稳定性影响较小，但小部分 FQs 对光敏感。由于含有苯并杂环结构和羧基、羟基等基团生成的共轭体系，FQs 分子在紫外光区 240~300nm 和 320~360nm 处均有吸收峰。FQs 是我国使用最广泛的几类抗生素之一，主要通过口服和注射方式使用。这类物质进入人体和动物体内后，只有小部分能被机体吸收，70%仍以原形及其降解产物被排出体外，这类废水最终进入污水处理厂进行集中处理。然而，现有的废水处理工艺对 FQs的去除效果有限，导致仍有一部分FQs进入自然环境中，给环境生态安全带来潜在的危害。
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1.2 FQs 的耐药机制 
由于人们不规范地使用抗生素，使得这类活性物质通过各种途径不断进入环境中，造成其―假持续‖的表象。长期暴露在低剂量的抗生素环境中，微生物会在环境选择压力下对抗生素产生抗药性。欧洲抗菌药消费监督委员会（European Surveillance  for  Antimicrobial  Consumption）发现在 2007~2010 年间，微生物对FQs 的抗药性有明显的增加趋势[2]。 通常，微生物对抗生素产生抗药性可以分为外因与内因。内因是位于微生物染色体上的基因发生突变引起，这种也叫做固有抗药性，能够通过生长繁殖保留下来。外因是通过质粒、整合子等遗传因子载体进行抗性基因的水平转移。目前，微生物的抗药性主要是通过质粒等载体的水平基因转移获得。基因的水平转移加快了抗性基因的扩散，，使抗性基因在不同微生物种之间传播，甚至导致多重耐药性微生物的出现。具有这些抗性基因的微生物可能通过各种途径进入人体，对人类及生态健康安全具有重大的危害。微生物对 FQs 的抗药机制主要有质粒介导喹诺酮耐药（plasmid-mediated  quinolone  resistance）和染色体介导喹诺酮耐药（quinolone resistance-determining region）。 
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第二章  环丙沙星在曝气生物滤池（BAF）中的污染行为特征   

2.1  曝气生物滤池系统装置平台的搭建及其稳定运行 
曝气生物滤池工艺是目前世界上应用最为广泛的污水处理工艺之一，其具备占地面积小、处理负荷高、基建投资少等优势。最初，BAF 的主要功能是去除有机物和截留固体物质。近年来，  BAF 处理技术得到了广泛的发展，被应用于屠宰场和造纸工业的废水处理[61]。目前，BAF 在我国还处于推广阶段[62]，它主要与微污染水处理和污水的深度处理。随着研究的深入，BAF 也同其他污水处理技术结合直接用于二级处理。 本研究采用 BAF 处理含有 CIP 的生活污水，研究曝气生物滤池硝化（反硝化）处理 CIP，以及 CIP 对 BAF 中硝化反应的影响。同时研究其对细菌微生物的抗性基因的形成及抗性菌群变迁的影响。 BAF 工艺基本原理如下：滤池中装有比表面积较大的滤料，污水在通过滤池时在滤料表面生长以微生物为主的生物膜。生物膜上微生物能够利用污水中的C、N 等营养元素进行新陈代谢，而使污水得以快速净化。同时，生物膜的絮凝作用和压实状态的滤料截留了污水中大量的悬浮物。随着系统的运行，不断生长的生物膜和截留下的 SS 使滤料层的空隙持续减少，系统的水头损失开始持续增大至严重影响系统的运行，甚至出水水质变差，这时需要对滤料层进行反冲洗，以更新生物膜和释放截留的固体物质。系统进行反冲洗后又开始进入高效运行阶段。 实验装置设计如图  2-1 所示。BAF 为一圆形有机玻璃柱，柱高 116cm，内径8cm，填料层高度为 90cm；在滤池上部设有溢流口与反冲洗排水口，底部设有处理进水口和反冲洗进水口；距滤池底端  10cm 设有曝气管，曝气管前段设有曝气头。BAF  以沸石为填充滤料。沸石由巩义市晟鑫水处理材料有限公司提供，沸石容重 1.4kg/m3，表观密度  1.8~2.2kg/m3，比表面积≥500m2/g，空隙率≥50%，盐酸可溶率<0.1%，抗压强度>4MPa，摩擦损失率<0.5%。 
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2.2 实验试剂 

CIP（纯度为 99%），NOR（纯度为 98%），均购自百灵威公司。甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国 Sigma-Aldrich 公司。碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、磷酸和乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验所需溶液的配制方法如下： （1）CIP 贮备液：精确量取 CIP 标准品 100mg 于 100mL 容量瓶中，配制成 CIP的标准储备液，浓度为 1g/L，置于 4?C 冰箱保存。使用时，用高纯水稀释到所需浓度。 （2）NOR 贮备液：精确量取 NOR 标准品 20mg 于 100mL 容量瓶中，配制成 CIP的标准储备液，浓度为 200mg/L，置于 4?C 冰箱保存。使用时，用高纯水稀释到指定浓度。 （3）Na2CO3标准液：准确称取 19.08g Na2CO3于 500ml 烧杯中，充分溶解用去离子水定容至 500mL，得 0.36mol/L 的 Na2CO3储备液。准确吸取 10ml  Na2CO3储备液用超纯水稀释定容至 1000mL 容量瓶，即为 3.6mmol/L 的 Na2CO3标准液 （4）NaHCO3标准液：准确称取 25.22g Na2CO3于 500ml 烧杯中，充分溶解用去离子水定容至 500mL，得 0.6mol/L 的 Na2CO3储备液。准确吸取 10ml  Na2CO3储备液用超纯水稀释定容至 1000mL 容量瓶，即为 6.0mmol/L 的 Na2CO3标准液 （5）NO2-标准溶液：准确称取 0.1848g 的 KNO2于 100ml 烧杯中，充分溶解用去离子水定容至 100mL，得 1000mg/L 的 NO2-储备液。 （6）NO3-标准溶液：准确称取 0.1629g  的 KNO3于 100ml 烧杯中，充分溶解用去离子水定容至 100mL，得 1000mg/L 的 NO2-储备液。 （7）流动相储备液液：用纯水配制 0.025mol/L  磷酸溶液，用三乙胺调节 pH=2.5后定容至 500mL，将配制好的 0.025mol/L  磷酸溶液同 HPLC 纯的乙腈以体积比50:50 进行混合，混合液即为流动相储备液。 

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第三章   CIP-ARGs 在 BAF 中的行为特征及演变规律 ......... 30 
3.1   实验材料 .......... 30 
3.1.1   实验试剂........ 30 
3.1.2   仪器设备........ 30 
3.1.3   缓冲液的配制 ....... 31
3.2   实验方法 .......... 31
3.3   结果与讨论 ...... 35     
3.3.1  生物膜中 CIR-ARGs 的检测 ........ 35     
3.3.2  出水中 CIR-ARGs 的检测..... 38         
3.3.3 CIP 与 CIP-ARGs 相关性分析 ...... 40
3.4  本章小结 .......... 41 
第四章   BAF 生物膜中微生物群落的研究 ....... 43 
4.1   实验用品 .......... 43
4.2   实验方法 .......... 44
4.3   结果与讨论 ...... 49
4.4   本章小结 .......... 55 
第五章   结论与建议 ...... 57 
5.1   结论 .......... 57 
5.2  展望 .... 58 

4.4   本章小结

本章主要讨论了 DO、CIP、氨氮对生物膜中微生物群落结构的影响，实验结论如下： 
（1）高通量测序结果表明，曝气生物滤池中优势菌属为 Proteobacteria、Bacteroidetes。其中，运行初期的曝气生物滤池中优势菌属还包括 Cyanobacteria。此外，检测出的优势微生物中都不包括反硝化细菌（在属的水平），这与 BAF 中较差的反硝化作用应相符合 
（2）入水氨氮的不同造成 BAF 中微生物群落结构的差异。2#BAF 中微生物丰度高于 3#BAF，但 3#BAF 中微生物多样性高于 2#BAF。2 组 BAF 中参与硝化过程的主要微生物为亚硝酸菌属（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）。同时数据表明，3 号中 Nitrosomonas、Nitrospira 丰度均高于 2 号样品，这与 3#BAF具有更高的硝化负荷相一致。 
（3）DO 从 5~6mg/L 下降至 1.5~2.5mg/L 时，BAF 中微生物丰度差别不大，但微生物多样性有所增大。Desulfobacter、  Zoogloea  、Dechloromonas 是 BAF 中三个最主要的菌属。DO 下降后，Acinetobacter  、Arcobacter  、Sulfuricurvum 的丰度明显降低，而 Flavobacterium、Thauera、Arenimonas 的丰度明显上升。 
（4）投加不同浓度 CIP 对 BAF 中微生物群落结构有较大的影响，微生物的多样性随着CIP浓度增大先下降后上升。BAF中优势菌属为变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。投加 50μg/L 的 CIP 后，硝化螺旋菌属（Nitrospirae）的丰度有所下降，但继续增加 CIP 浓度对其没有明显作用。而蓝藻门（Cyanobacteria）的丰度在投加 CIP 后明显下降，表明其对 CIP 的存在较敏感。此外，高浓度 CIP 对绿菌门（Chlorobi）  和绿弯菌门（Chloroflexi）没有抑制作用，使得其丰度上升。  
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结论

本文以曝气生物滤池作为研究对象，考察了 DO、C/N、CIP 的初始浓度对BAF 中 COD 去除和硝化作用影响，同时检测其对 CIP 的去除作用，采用荧光定量 PCR 方法定量检测分析了 4 种 CIP-ARGs 在此过程中的丰度变化，并采用PCR-DGGE 结合高通量测序技术检测 BAF 中微生物群落结构的变化。主要研究结论如下： 
（1）当 DO 下降时，3 组 BAF 中 COD 的去除率分别平均下降了 9.99%、9.54%、11.64%，但有机物仍可得到较好的去除。而 3 组 BAF 中氨氮平均去除率分别下降 51.8%、51.9%、34.2%，出水中 NH4+-N、NO2-和 NO3-浓度有明显变化，表明DO 的改变对硝化作用有极大的抑制作用。此外，2 组装置中 CIP 去除率明显开始下降，其平均去除率分别下降了 7.9%、9.2%。 
（2）C/N 增大后，BAF 中 COD 去除率都有所增大，COD 去除率上升了17.69%~18.66%。同时，BAF 出水中 NH4+-N、NO2-和 NO3-浓度也有不同程度的改变。出水 NH4+-N，NO2-浓度都有所下降，而出水 NO3-浓度则增大，C/N 值增大在一定程度上促进了硝化反应的进行。同时，CIP 的去除率随入水 C/N 值增大而有所增大，但增幅较小。 
（3）当进水 CIP 浓度为 0~300μg/L 时，3 组 BAF 中 COD 的去除效果相对稳定。投加 50μg/L 的 CIP，BAF 中硝化过程基本没有影响。但 CIP 浓度增大到 300μg/L时，NH4+-N 出水浓度增大，表明高浓度 CIP 对氨氧化过程有抑制。同时，CIP的去除率随着投加 CIP 升高而略有减少。此外，在整个系统运行期间中，3#BAF中的 CIP 去除率都高于 2#BAF，表明硝化反应有利于 CIP 的生物降解率。此外，BAF 中的 TN 去除率较低，反硝化反应较弱，基本可以不考虑反硝化作用。 
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参考文献(略)

本文编号：62024