东南亚三种人参属植物的比较及三七中皂苷合成关键酶基因的研究

发布时间：2016-06-29 22:08

第二章 三种人参属植物 HPLC 代谢图谱的研究

2.1 引言

在发展中国家包括越南和中国的经济落后地区，正确的识别中药和寻求促进中药的合理使用对保证中药材的质量是至关重要的。事实上，这些地区很少种植中药材，所有的中药材都是通过自然植被获得的，因此，误认和掺假经常发生。但是，目前并没有相关报道显示如何识别和辨别这三种人参属植物。本研究的目的是利用更加合适的条件建立一套可行的 HPLC 方法，基于该 HPLC 方法，我们建立这三种人参属植物的指纹图谱来识别和鉴别这三种植物。此外，在指纹图谱的基础上，应用相似性分析（Similarityanalysis）、聚类分析（Hierarchical clustering analysis）和主成分分析（Principal componentanalysis）等化学计量法来研究这三个物种及其样品间的关系。

2.2 材料、试剂与仪器

26 个植物材料均收集或购买于东南亚的不同地区（表 2-1），45℃下烘干。所有的材料均由云南省文山州三七研究院陈中坚研究员鉴定。通常情况下，三七的种植需要一年的时间来育苗，之后从苗床移栽到田地，最终两年之后被采收。三七的样品由不同肥料处理和不同年限采收的材料组成，其中，，不同肥料处理一年的样品 S1~S16（表 2-2）试验在云南省文山州苗乡三七科技示范园（23°32' N, 104°19' E, 海拔 1500 m）完成，每个处理取 5 株三七作为试验材料。此外，所有的样品分别用小型粉碎机粉碎成粉末并过200 目的筛子。

第三章 三种人参属植物挥发油成分的比较.....37

3.1 引言 ......37
3.2 材料、试剂与仪器.....37
3.3 方法....38
第四章 三种人参属植物的遗传多样性及其遗传距离....47
4.1 引言.....47
4.2 材料、试剂与仪器......48
4.3 方法 ...49
第五章 三七不同部位主要成分的研究........58
5.1 引言....58
5.2 材料、试剂与仪器.......59
5.3 方法.......60

第八章 三七中皂苷合成关键酶基因的原核表达研究

8.1 引言

植物体中绝大多数蛋白酶的含量极低，为了进一步研究各种酶的蛋白结构及其体外活性等，我们需要高含量的蛋白作为研究材料。原核表达可以通过将外源目的基因连接到特定的表达载体中并导入表达菌株的方法，在特定原核生物或细胞内大量表达。原核表达具有操作简单、快捷、需时较短、表达产量高和适合工业化等优点。目前，原核表达已经广泛应用于多种药用植物次生代谢关键酶基因的研究中，并在大肠杆菌等菌株中得到了大量表达 (常立等 2014; 胡薇等 2012; 陶韵文等 2014)。为了得到三七中皂苷合成的关键酶，我们在本章节中构建了三七中皂苷合成关键酶基因的原核表达体系，这将为获得三七中皂苷合成几种关键酶提供了有效途径，并为其体外酶活试验提供基础。

8.2 材料、试剂与仪器

为了鉴定诱导出来的蛋白是包涵体还是可溶性蛋白，需要对菌体进行破碎，具体操作步骤如下：1. 取 8.3.12 中活化后的菌液进行扩大培养，用终浓度为 0.6 mM 的 IPTG 诱导蛋白表达，根据摸索出的最佳诱导时间收取菌液；2. 用 50 mL 的离心管收集菌液，在 4℃，8000 rpm 下离心 3 min。倒掉上清，加入 40 mL的 ddH2O 洗一遍，4℃，12,000 rpm 离心 2 min；3. 倒掉上清，用适量的 PBS 悬浮菌液（每克 10mL）；4. 用低温超高压连续流细胞破碎机对悬浮起来的菌体进行破碎 3~5 次，破碎前后的菌液始终在冰水混合物中，这样蛋白不易变性；5. 将破碎后的菌液在 4℃，7800 rpm 条件下离心 30 min；6. 将上清蛋白用 0.22 μm 滤膜过滤，沉淀部分用 PBS 缓冲液悬浮；7. 分别制备上清和沉淀的蛋白上样液，进行 SDS-PAGE 电泳，通过观察电泳结果，可以确定所诱导蛋白是包涵体还是可溶性蛋白。
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第九章 总结论和创新点

本研究在 HPLC-PAD 基础上，采用化学指纹图谱结合化学计量法，分别建立了三种人参属植物的化学指纹图谱，通过比较它们模拟中值色谱图中的 22 个特征峰可以很容易将它们区分并辨认；通过常用的化学计量法——相似性分析、聚类分析和主成分分析研究不同样本之间的关系得出结论：越南三七和屏边三七在皂苷成分上与三七相比具有更高的相似性，而三七在皂苷成分上具有更高的多样性，不同的生长年限和肥料处理对三七中皂苷种类的影响极小。另一方面，本研究利用 GC-MS 分析比较了三种人参属植物挥发油的成分，三个物种含有数量相似的化学成分（约 70 种），但是每种化合物的含量差异较大；三个物种的挥发油中共鉴定出了 120 种化合物，其中三个物种共有的化合物为 26 种，两个物种共有的化合物为 31 种，三个物种挥发油的主要成分均是具有良好生物学活性的镰叶芹醇；基于它们挥发油成分的聚类分析显示，越南三七和屏边三七在挥发油成分上具有更高的相似性。

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参考文献（略）

本文编号：63481