大豆 7S、11S 球蛋白与分离蛋白影响面团特性及馒头品质的机理研究
第一章 文献综述
小麦是世界上主要粮食作物之一，在我国，小麦作为第二大作物，其种植面积和产量仅次于水稻。我国小麦的年产量呈逐年递增趋势，2011 年小麦年产量 11740.09 万吨，2012 年小麦年产量 12102.36 万吨，2013 年小麦年产量 12192.64 万吨，2014 年小麦年产量 12620.84 万吨。2014 年与 2011 年相比小麦的年产量增加了近 8%。（数据来自国家统计局）。面制品的主要原料之一是小麦，全球大约三分之一的人口是以面制品为主食，它为人类摄取蛋白质提供大量来源，远高于其它粮食作物。据统计，世界小麦蛋白质数量等于肉、蛋、奶蛋白质的总和。但是小麦蛋白中缺乏赖氨酸，因此在小麦粉中添加赖氨酸含量高的蛋白质可以提高小麦粉中蛋白质含量，并平衡小麦蛋白质中必需氨基酸含量，提高小麦蛋白的营养价值。
大豆蛋白质必需氨基酸含量高，属于优质蛋白质。大豆是主要的豆类作物之一，2010～2014 年大豆、绿豆、红小豆及豆类总年产量如图 1-1（数据来自国家统计局），由图 1-1 可以看出，在我国大豆年产量远远高于绿豆及红小豆，居豆类之首。大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白、蛋白粉、大豆酶解蛋白等（统称大豆蛋白）是以大豆为原料制备的，而食品工业中，如乳品、饮料、面制品、肉制品、面制品等的生产均离不开大豆蛋白。现如今，人口迅速膨胀而耕地面积大大减少的严峻形势下，人们对大豆蛋白这种具有高营养、高产量的植物原料蛋白质引起广泛关注。大豆蛋白加工在我国已呈现迅猛发展态势，其中大豆食品蛋白加工出口量占世界市场的 50%。据专家估计，全球对大豆蛋白的消费量将会持续上升。以我国为例，2012 年实际消费大豆 6400万吨，占全球实际消费的 25%。用于食品加工的国产大豆总量超过 1000 万吨，其中 30%用于大豆分离蛋白生产，年产量达 70 万吨(韩飞等 2013)。国内市场上，多数肉制品的生产加工过程会添加大豆蛋白，而我国肉类年产量高达 7000 万吨，约占世界肉类总量的 30%，但是深加工比率仅有 4%～5%，远低于发达国家的 50%～70%，随着科技的发展，肉制品的深加工水平不断提高，大豆蛋白的需求也日益凸显，按 30%的肉制品深加工产品比率计，国内大豆蛋白年需求量达 30 万吨，2014 年全球大豆蛋白年需求量在 150万吨～200 万吨，初步估算，大豆蛋白年需求量会以每年 10%～15%的速度递增（韩锦等 2014）。国际市场上，大多包装食品生产中也有大豆蛋白的应用。目前在食品生产工业上，我国已向 100 多个国家出口大豆蛋白。大豆蛋白具有的多种功能特性与产品质量有直接影响，当大豆蛋白和其它食品原料搭配使用时，可以使其营养价值得到显著的改善，此外，它对于改善加工食品的质构特性也具有重要影响(Gan et al. 2009, López et al.2012, Mohsen et al. 2009)。目前，学者们主要对大豆蛋白的精深加工进行深入研究，旨在开发一种具有更高的附加值、应用价值的大豆蛋白产品。
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1.2.1 小麦蛋白质概述
小麦一般含有 9%～13%的蛋白质，小麦蛋白质是人们日常食物蛋白质的主要来源。通常将小麦蛋白质分为面筋蛋白（一般大约占小麦蛋白总量的 85%）和非面筋蛋白（一般大约占小麦蛋白总量的 15%）（Veraverbeke et al. 2002）。在生面团中能形成网络的蛋白称为面筋蛋白，生面团的粘弹性由面筋蛋白质决定(Wang et al. 2014)。小麦蛋白质的分类分布状态如图 1-2 所示。人畜必需氨基酸与小麦必需氨基酸含量如表 1-1。
根据水洗程度的不同，干物质包含 75%～85%的蛋白质和 5%～10%的脂质，剩余物中大部分为淀粉和非淀粉类的碳水化合物。在实际中，“面筋”是指蛋白质，也叫面筋蛋白。因为它们决定了小麦粉的焙烤特性，赋予小麦粉生面团吸水性、结合性、粘性和弹性。面筋蛋白与非面筋蛋白不同，其在水或者稀盐溶液中具有较低的溶解性。导致其低溶解性的主要因素为可电离的氨基酸侧链含量低，非极性氨基酸和谷氨酸盐的含量高，而非极性氨基酸和谷氨酸盐很容易与水形成氢键。因此，使谷蛋白完全溶解而不影响其内部结构显然是不可能的。
面筋蛋白包含几百种蛋白质组分，它们以单体或者通过链间二硫键连接形成的低分子或高分子聚合物存在（Wrigley et al. 1988）。根据不同的氨基酸组成，它们具有不同的特性，其组成特点为谷氨酸盐和脯氨酸含量高而带有其它官能团氨基酸含量低。天然面筋蛋白质的分子量甚至超过 20000KDa。习惯上，根据它们在酒精水溶液（例如：60%的乙醇）中的溶解度，大致将面筋蛋白分为可溶的麦醇溶蛋白和不可溶的麦谷蛋白。麦醇溶蛋白的含量为小麦蛋白总量的 40%～50%,麦谷蛋白的含量为小麦蛋白总量的30%～40%。由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测得麦醇溶蛋白单体的分子量为30KDa～80KDa (MacRitchie et al. 1990)，，麦谷蛋白聚合物的不均匀混合物分子量范围在80KDa 至几千 KDa (Masci et al. 2002)。
（1）麦醇溶蛋白
大部分麦醇溶蛋白以单体形式存在，在低 pH 条件下进行凝胶电泳，以迁移速率为基础，最初将它们分为四组（α-，β-，γ-，ω-麦醇溶蛋白），其迁移速率依次减小。后来，对氨基酸研究结果表明，分子的迁移速率不总能反映蛋白质之间的关系，也不一定能反映 α-，β-麦醇溶蛋白的分组(α/β-类型)。现今的研究方法，例如二维电泳法或反相高效液相法(RP-HPLC)能够将麦醇溶蛋白分为一百多个组分。基于对完整和部分氨基酸的研究发现，根据氨基酸组成和分子质量，可以将它们分为四种不同类型：ω5-，ω1,2-，α/β-和 γ-麦醇溶蛋白(Wieser 1996)。
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第二章 大豆 7S 和 11S 球蛋白的提纯及鉴定
大豆是重要的植物蛋白质资源之一，与谷类作物蛋白相比，大豆具有蛋白质含量高、氨基酸平衡性好，以及乳化性、凝胶性、吸油性等优良的功能特性而被广泛应用于食品、医药和动物饲料等多个领域。低温豆粕蛋白含量达 45％～52％，低温豆粕中蛋白质变性程度小，大多大豆蛋白产品都是以低温豆粕为原料制得的，因此其具有较高的开发利用价值（刘中华和曾维丽 2011）。7S 和 11S 是大豆蛋白的两个主要组分，7S 的等电点 4.8左右，11S 的等电点 6.4 左右。目前主要是根据此原理对大豆中 7S 和 11S 组分（本文如无特殊说明 7S 和 11S 均指大豆中的组分）进行分离。7S 和 11S 的分离方法应用最多的是 Thanh 法（Thanh et al. 1975）和 Nagano 法（Nagano et al. 1992）。许多研究者都采用这两种方法制备 7S 和 11S 组分（李成贤 2007；徐君 2009；黄行健 2010；朱晓烨等2011；宋佳等 2013；Tarone et al. 2013；Teng et al. 2009）。这些研究分别针对 7S 和 11S组分的得率、蛋白质含量或者纯度进行了大量提取，但同时考虑得率和纯度的分离纯化技术研究较少。
鉴定蛋白质纯度的方法有多种，如 SDS-PAGE 电泳法、N-末端氨基酸残基分析、等电聚焦电泳法和高效液相法等。由于许多蛋白质的性质相似，控制一个条件将两个蛋白质分开的可能性较小，因此，单独采用任何一种分离鉴定的方法都不能完全确保蛋白质的纯度，必须同时选取 2～3 种不同的纯度鉴定方法才能确定（田琨 2010）。本研究以脱脂豆粉为原材料，优化了 7S 和 11S 的提取方法，同时分析 7S 和 11S 的提取率和纯度，以期提高两组分得率和纯度。采用 SE-HPLC 和 SDS-PAGE 法对 7S 和11S 的纯度及亚基分子量进行分析，并和标品进行对照。最终确定适合本试验的 7S 和11S 提取方法。这对 7S 和 11S 的应用及与其它成分之间的相互作用具有重要意义。
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2.2.1 材料和试剂
脱脂豆粉（TSF）蛋白质含量 54.2%：郑州同创益生食品有限公司；甘油（丙三醇）；乙醇；冰醋酸；95%乙醇：天津市天力化学试剂有限公司；电泳凝胶配制试剂盒：博士德生物技术有限公司；考马斯亮蓝 R-250：上海蓝季科技发展有限公司；SDS：天津市光复精密化工；盐酸：洛阳市昊华；三氨基甲烷（Tris）：上海市山浦化工有限公司；甘氨酸（氨基乙酸）：天津市科密欧化学试剂有限公司；AP（过硫酸铵）：洛阳市化学试剂厂；15 - 600 kDa 蛋白标品：Sigma，808541，色谱级；大豆 7S 球蛋白标品：Sigma，C5868，色谱级；大豆 11S 球蛋白标品：Sigma，G3171，色谱级。化学试剂均购自郑州新风化学试剂有限公司，为分析纯。
2.2.2 仪器与设备
HMS-3C 型精密酸度计：台州市新恩精密粮仪器有限公司；GL-20C 型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；D-37520 型高速冷冻离心机：德国 Kendro 公司；2300K 全自动凯氏定氮仪：瑞典 FOSS TECATOR 公司；AY120 型分析天平：岛津国际贸易（上海）有限公司；DDY-6D 型电泳仪：北京市六一仪器厂；1200 高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司（中国）；SEC G4000SW 高效排阻液相色谱柱：日本 TSK 公司。2.2.3 试验方法
11S 的提取中，沉淀 pH 及 4℃ 放置时间是影响 11S 得率及纯度的主要因素（Denget al. 2012）。本试验通过调节沉淀 pH（6.2、6.3、6.4、6.5、6.6）及 4℃ 放置时间（8 h、10 h、12 h、14 h、16h）来研究其对 11S 提取的影响。7S 的提取中，关键在于除去 11S和中间组分，但有研究表明，α 和 α'的等电点分别为 5.2 和 5.3，在分离出 11S 后调 pH5.0会使部分 α 和 α' 亚基沉淀为中间产物而损失（Hou and Chen 2008）。因此本试验拟提高除去中间产物时的 pH（5.2、5.3、5.4、5.5、5.6），以期在不影响 7S 纯度的基础上提高 7S 的得率。7S 和 11S 的提取流程参照文献并作修改（Liu et al. 2007），如图 2-1 所示。
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3.1 前言............................................................. 40
3.2 材料与方法.................................................... 41
3.2.1 材料和试剂................................................... 41
第四章 大豆 7S、11S 球蛋白与分离蛋白对馒头品质特性的影响规律研究......66
4.1 前言.............................................................. 66
4.2 材料与方法........................................................ 67
4.2.1 材料和试剂...................................................... 67
第五章 大豆 7S、11S 球蛋白与分离蛋白对小麦蛋白作用机理研究..............81
5.1 前言................................................................ 81
5.2 材料与方法...................................................... 81
第五章 大豆 7S、11S 球蛋白与分离蛋白对小麦蛋白作用机理研究
在生产和消费中小麦是最重要的谷物之一。食物蛋白质的氨基酸组成中，如果某一氨基酸缺乏，将影响整体蛋白质的营养价值，如：小麦蛋白质中缺少赖氨酸(Martínez-Villaluenga et al. 2010)。为了增加面制品中氨基酸的平衡，可以在面制品中添加大豆蛋白(Roccia et al. 2009; Wilson et al. 2007)。但是众所周知，小麦-大豆复合配会降低面团的品质，还会使其焙烤性变差(Gupta et al. 2011; Mohammed et al. 2014; Ribotta etal. 2005)。大豆蛋白不利于面团形成。这主要是由于大豆蛋白和小麦蛋白之间的差异造成的，如水溶性、一级结构的不同和粒度分布等。面团的粘弹性是小麦蛋白特有的。面团混合时大豆蛋白和面筋蛋白会发生相互作用。研究大豆蛋白和小麦蛋白之间的相互作用有利于深入了解如何降低面团中的大豆蛋白对面团的弱化效应。
先前的研究认为大豆蛋白对面团形成的负作用主要是由于大豆蛋白与小麦面筋蛋白之间相互交联太少(Ryan et al. 2002b)。最近关于大豆蛋白与小麦蛋白之间相互作用的研究成为热点（Don et al. 2005; Ribotta et al. 2005）。一些研究者发现大豆蛋白与小麦蛋白之间是通过非共价键相互作用的，因为通过对面团和小麦-大豆复合面团中的巯基进行分析，并没有发现有所改变。其他人认为大豆蛋白和小麦蛋白通过非共价键和共价键（二硫键）相互作用，而且作用程度取决于大豆蛋白形态(Ribotta et al. 2005)。尽管这些研究对于理解大豆-小麦面团所产生的一些物理、化学及流变学特性的改变起到了一定的作用。然而大豆蛋白与小麦蛋白在分子层面的研究还较少，7S 和 11S 是大豆蛋白的主要组分，关于提纯后的 7S 或 11S 与小麦蛋白作用的研究尚未见报道。在本论文第三章的研究中，发现 11S 或 7S 会影响面筋的形成并弱化面团。这为研究 7S 或 11S 与小麦蛋白作用机理提供理论依据。
本章采用 NMR 分析 7S、11S、SPI 对水分迁移特性的影响，通过紫外、SE-HPLC、SDS-PAGE 研究 7S、11S、SPI 与小麦蛋白之间的作用机理。深入探讨大豆蛋白及其组分与小麦蛋白之间作用的分子机理，以期找到加入大豆蛋白降低面制品品质的原因，从而为大豆蛋白在面制品中应用和改良提供理论基础，拓宽大豆蛋白在面制品中的应用。
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第六章 结论、创新点与展望
随着人们物质生活水平的提高，对传统面制品不仅从营养，从功能和品质上的要求也越来越高。将大豆蛋白添加到面制食品中应用，既增加了蛋白质含量，又提高了蛋白质营养质量。因此，将大豆蛋白产品添加到面制品中是今后的发展趋势。本论文目的是研究 7S、11S、大豆分离蛋白对面团流变学特性及馒头品质的影响规律及 7S、11S、大豆分离蛋白对小麦蛋白的作用机理，为大豆蛋白在面制品中的应用奠定了理论基础，对改善面制食品的营养、加工品质、扩大大豆蛋白在面制食品加工中的应用范围等都有较大意义，因而具有重要的理论意义和应用价值。内容主要包括以下三个方面：首先以脱脂豆粉为原料，对大豆蛋白的主要组分（7S 和 11S）进行提纯和鉴定，为后续试验奠定原料基础；其次将大豆分离蛋白加入到不同种类的小麦粉中，研究其对混合粉面团特性及馒头品质特性的影响规律，分析大豆分离蛋白对混合粉面团特性及馒头品质特性的影响规律与小麦粉品质的相关性，并探讨加入大豆分离蛋白后混合粉的面团特性与馒头品质特性各指标的相关性。将提纯后的 7S 和 11S 添加到小麦粉中与之混合，比较其对小麦粉面团的流变学特性及馒头品质特性的影响，为深入研究其对小麦蛋白作用的机理打下基础；最后研究 7S、11S、大豆分离蛋白对小麦蛋白作用机理。以下为本研究的主要结论、创新点；同时，对相关研究的发展趋势进行展望。
6.1.1 大豆7S和11S球蛋白的提纯及鉴定
首先，对 SE-HPLC 的色谱条件进行优化，确定最佳的色谱条件为：洗脱液（水/乙腈）70/30，洗脱液流速 1.0 mL/min，进样量为 10μL。根据优化的色谱条件对 7S 和 11S标品进行采样，以 10 倍信噪比确定定量限，得到 7S（y=299.59x+3.7712，R2=0.9792）和 11S（y=197.08x+4.1485，R2=0.9861）纯度分析标准曲线方程，该标准曲线方程可以用于 7S 和 11S 纯度的分析。同时以提取率和纯度为定量指标确定 7S 和 11S 提纯的最佳工艺参数（11S 的沉淀 pH 值为 6.4、11S 静置时间为 12 h、7S 的沉淀 pH 值为 5.4），在此条件下提纯 7S 和 11S 的得率分别为 20.9%和 17.3%，7S 和 11S 的纯度分别达到 86.3%和 92.0%。其次，采用 SE-HPLC 法分析 7S 和 11S 的分子量，分子量标准曲线方程为Log(M)=-0.2221x+3.8789，决定系数为 R2=0.9969。将所提纯的 7S 和 11S 样品的分子量与 7S 和 11S 标品分子量进行比对，表明所提纯样品为 7S 和 11S，能被后续试验所用。最后采用 SDS-PAGE 法进一步验证了 7S 和 11S 分子亚基的分子量，并用凝胶分析软件对 7S 和 11S 的纯度进行分析，并和 SE-HPLC 法测的纯度比较，进一步验证所得 7S 和11S 的纯度。为后续试验奠定了原料基础。
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参考文献（略）
本文编号：84421
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/84421.html
