水稻土亚铁氧化耦合硝酸盐还原的过程与机制

发布时间：2016-08-04 09:57

第一章  引  言

第一节  土壤铁循环
铁元素是地壳中的第四丰富的元素，也是重要的活性金属元素，同时又是华南地区土壤里的氧化还原元素（Hauck et al., 2001）。铁元素以各种类型的氧化物存在，包括磷酸盐，碳酸盐，硫化物等各种矿物的形式，在包括土壤环境中的在各种生境中均有存在（Roden et al., 1996）。在包括河流沉积物和土壤的生境里，重复进行的亚铁的氧化还原过程形成了一个不断运动的铁轮，同样会推动其他相关物质的氧化还原过程。 长期以来，铁的氧化和还原过程被认为是化学过程，在 p H 为中性的好氧环境下，Fe(II)的氧化主要由氧气引起的化学过程( Lovely et al. 1992)。然而，在厌氧环境下（如土/水界面），铁氧化还原过程不是自发的化学过程，而是需要有微生物作为介导的。此时的 Fe(II)的氧化则是由微生物引起的——除了光合型的微生物外，主要是硝酸盐依赖亚铁氧化微生物所作用的，乃至少量的微氧型亚铁氧化菌的作用。这些微生物究竟是如何影响铁的氧化还原过程进而影响到氮循环的过程，是国际上一个比较感兴趣的问题。厌氧环境中三价铁还原菌，亚铁氧化菌通过其自身的酶促反应，推动着铁轮的不断的滚动。这类微生物可以将 Fe(II)作为电子供体，本身缺乏充分的产能体系。在有硝酸盐作为电子受体的避光环境下，这类微生物将 Fe(II)  （包括 Fe2+，Fe(II)-citrate，Fe(II)-picolinate，Fe(II)-NTA，Fe(II)-EDTA 和固态的 Fe S，Fe CO3）氧化成 Fe(III) (Straub et al., 2001; Kumaraswamy et al., 2006; Zhang et al., 2009; Klueglein and Kappler, 2013)；又因为同时具有反硝化和异化硝酸盐还原成氨的代谢途径，而成为铁循环和氮循环耦合的联系点(Straub et al. 1996; Li et al., 2016)。铁本身的化学属性十分的活泼，在 p H小于 4 的时候可以在有氧状态下保持稳定，，但在 p H 大于 5 时可以自发的被空气或者溶液中的氧气迅速的氧化成 Fe(III)。
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第二节  亚铁氧化过程及其相关微生物 
亚铁氧化作为铁循环的重要组成，其作用机制同样引起了许多的关注。亚铁可以被氧气进行化学氧化，也可以被微生物所驱动发生生物氧化。此外，在生物驱动的亚铁氧化里面，也包括着一些不是酶促反应的化学反应(Klueglein  and Kappler, 2013)。因为迄今为止，许多分离到的亚铁氧化微生物多是异养型或者混合营养型的，这类微生物在还原硝酸盐时生成大量的亚硝酸盐。在酸性 p H 条件下，亚硝酸盐本身并不是十分的稳定，很容易通过化学反应生成其他的代谢产物如二氧化氮和一氧化氮。另外，亚铁也很容易被这些生成的亚硝酸盐进行化学氧化。在中性 p H 条件下，即使亚铁和亚硝酸盐的反应速度比起酸性条件下有所减缓，但二者之间的反应仍然十分显著(Klueglein et al., 2015)。所以，一般认为，微生物代谢，即酶促反应引发的亚铁氧化过程多发生在 Fe(III)矿物或者是其初产物（如绿锈）上。硝酸盐的还原需要微生物作为媒介，一旦亚硝酸盐生成以后，化学因素所起的因素可能更大。 在厌氧环境中，亚铁氧化微生物是整个亚铁氧化过程的主要的驱动力。二价铁氧化菌中，光合型的细菌利用光能作为能源，以亚铁作为电子供体(Kappler et al. 2005)；硝酸盐依赖型以硝酸盐作为电子受体，通过还原硝酸盐获得能源进行生长。中性和酸性的细菌则通过把氧气作为电子受体以获得能量进行代谢。 
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第二章  三种母质发育的水稻土中性亚铁氧化耦合硝酸盐还原动力学及其微生物机制 

第一节  材料和方法
本样品所采集的水稻土为广东省广州市中国科学院花岗岩发育(23°10'38.26" N, 113°21'10.12" E)试验田（Botanical Garden, BG）的新鲜的水稻土（花岗岩发育），采集的时间为 2013 年的冬季，水稻田处于抽干状态。采集的样品的深度是水稻土表层以下约 10 cm，放置于 0  ℃冰盒带回实验室的厌氧工作站内，1 天后传代试验开始。另外于 2014 年秋季采集了石灰岩发育隆安县南坪镇三宝村(23.4901° N, 107.64695° E)试验田（Guangxi, GX）的水稻土（石灰岩发育）。于 2015 年初采集广东台山都斛镇(22°04'37.54" N, 112°56'59.33" E)最靠近海边的农田（Taishan, TS）水稻土（沉积物发育）。水稻土的基本理化性质如表 2.1 所示。本研究将 1%的水稻土接种在适合硝酸盐依赖型 Fe(II)氧化微生物生长的培养体系中，对水稻土进行反复驯化——即在 Fe(II)已经被微生物充分氧化成 Fe(III)氧化物后，吸取十分之一体积的培养物到新配置的培养体系内，测试 Fe、N 和乙酸盐相关物质的动力学变化，为了使整个培养体系处于一个严格厌氧的状态，采用高纯氮气（99.99%）鼓吹至少 30 min，并迅速的压上橡胶盖和铝盖的方式。所有的西林瓶均放置在恒温培养箱采用厌氧恒温培养方法（30  ℃）让 Fe-N 相关的微生物在高浓度的亚铁和硝酸盐环境中发挥其功能。每个反应有 3 个重复。 
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第二节  水稻土中亚铁氧化与硝酸盐还原转化动力学
本研究模拟了水稻土在中性 p H 厌氧条件下微生物驱动亚铁氧化耦合硝酸盐还原的过程（图 2.1 和 2.2）。 在花岗岩发育原始水稻土里，NO3-和 NO2-的浓度不到 0.01  m M，和添加进去的NO3-以及生成的 NO2-浓度相比，只能作为一个背景值存在。水稻土里的 NH4+的浓度可以达到大约 0.25 m M。NH4+可以被水稻土里的微生物进行同化，这导致了 Soil+Fe(II)处理中 NH4+的浓度逐渐下降。在石灰岩发育和沉积物发育的水稻土中，NO3-和 NO2-的浓度同样很低，只是不到 0.01  m M；体系中存在着一定浓度的 NH4+，NH4+的浓度分别约为 0.3 m M 和 0.2 m M。 之前的研究也表明，硝酸盐还原速率在有 Fe(II)存在的情况下会有所减缓。微生物对硝酸盐还原的代谢路径分为反硝化路径  (NO3-→NO2-→NO→N2O→N2)和异化硝酸盐还原成铵路径  (NO3-→NO2-→NH4+)  (Weber  et  al.  2006)。硝酸盐和亚铁在中性 p H 厌氧的条件下由微生物作用下的反应可用以下反应式子表示：4Fe(II) + 2NO3- +H+ → 4Fe(III) + NO2- + 3H2O。 在 花 岗 岩 发 育 水 稻 土 中 ， Soil+NO3-处 理 的 NO3-的 还 原 速 率 比 起Soil+Fe(II)+NO3-处理组要快速。在 4～6 天的时间里，Soil+Fe(II)+NO3- 和 Soil+NO3-处理的 NO2-的生成呈现一个快速上升至 3.5～4 m M 然后下降的趋势。在这两个处理中，均检测到有 N2O 的生成。这说明无论是在水稻土体系，或者是梯度稀释后的纯细菌体系里，NO3-的还原在 Soil+Fe(II)+NO3- 和  Soil+NO3-处理中均有走反硝化途径，N2O 的生成并不会受 Fe(II)加入的而造成干扰。同时，有大约 1 m M 的 NH4+在 Soil+Fe(II)+NO3- 和  Soil+NO3-处理中被检测到，表明硝酸盐还原也走异化硝酸盐还原成铵的路径。在第 3 轮和第 4 轮循环里，NH4+的生成量在 Soil+Fe(II)+NO3-的处理中要小于在 Soil+NO3-的，表明 N 在水稻土体系中的损失可能更多的走反硝化路线。 
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第三章  新菌 Rhodocyclaceae sp. Paddy-1 的筛选 ......... 53 
第一节  材料和方法 ............ 54 
一、菌株 Paddy-1 的分离和鉴定 ......... 54 
二、实验设计 ..... 56 
三、理化指标检测方法 ....... 57 
四、16S r RNA 的 PCR 扩增，克隆，序列测定和系统发育分析............ 57 
五、全基因组测序方法 ....... 58 
第二节  新菌 Paddy-1 驱动的 Fe(II)氧化耦合 NO3-还原动力学 .... 59 
第三节  菌株 Paddy-1 驱动的亚铁氧化耦合硝酸盐还原的机制探讨 ..... 65 
一、Fe(II)氧化的相关基因 .......... 65
 二、NO3-还原的相关基因 ............ 70 
三、Fe(II)氧化在细胞上代谢通路的构建 ..... 71 
第四节  本章小结 ....... 72 
第四章 Cupriavidus metallidurans Paddy-2 的筛选......... 75 
第一节  材料和方法 ............ 76
第二节 Paddy-2 介导的 Fe(II)氧化耦合 NO3-还原动力学 ..... 80 
一、Fe(II)氧化动力学 ......... 80 
二、NO3-还原动力学 ........... 81 
第三节  生物成矿及其表征 ......... 82 
第四节  Paddy-2 驱动的亚铁氧化耦合硝酸盐还原的机制探讨 ..... 86 
第五节  本章小结 ....... 89 

第四章 Cupriavidus metallidurans Paddy-2 的筛选及其亚铁氧化耦合硝酸盐还原的机制探讨

铁在耦合其他元素的生物地球化学循环过程中处于一个核心的位置(Lehtoranta and Ekholm, 2014)。大量利用 Fe(III)作为电子受体进行异养生长，利用 Fe(II)作为电子供体进行化能或光能进行异养或自养生长的微生物已经被分离出来(Weber et al., 2006)。水稻土是一个典型的人工湿地生态系统，这个生态系统的形成可以归因于其剧烈的生物地球化学过程，很大程度上取决于人类活动的影响(K?gel-Knabner et al., 2010)。人类对水稻土的利用是周期性的进行作物种植，导致了水稻在不同时期交替性的产生厌氧-好氧环境(Ratering and Schnell, 2001)。在稻田的淹水期时，Fe(III)还原产生了大量的 Fe(II)，而在稻田排水后，在氧气和亚铁氧化菌的共同作用下被还原的 Fe(II)被重新氧化(Long-Jun et al., 2014)。华南地区的水稻土中含有较丰富的铁元素，这类铁以 Fe(II)或 Fe(III)离子，水铁矿，纤铁矿，针铁矿，施氏矿物的形式存在(Maher et al., 2009)，并且在微生物或者其他理化因素的作用下相互转化。此外，为了促进作物的增产，人类往往会人为的往稻田添加大量的高含氮量的肥料，从而引发了水稻土里强烈的氮循环过程。在接近中性 p H 的水稻土环境中，铁循环和氮循环可以由微生物作为―桥梁‖进行耦合。这类微生物中以硝酸盐依赖型亚铁氧化菌作为典型，被视为研究这个机制的模式生物(Carlson et al., 2012)。 

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结论

从花岗岩发育水稻土中成功分离到一株具有硝酸盐还原耦合亚铁氧化功能的新菌，其 16S r RNA 基因与最接近的 Rhodocyclaceae 科的细菌只有 94%的相似性，属于一个新属级别。 菌株在中性 p H 厌氧进行 Fe(II)和 NO3-共培养 6 天后约 85%的 Fe(II)被氧化，10  m M  NO3-大约有 93%的被还原，但只有检测到 1.2 m M 的 NO2-生成量。NO2-两个副产物 N2O 和 NH4+的生成量分别只有约 0.2  m M 和 0.04  m M，表明大量的N 元素进入 N2中。Fe(II)的加入使得 NO3-的还原速率和副产物的生成速率均有所减低，表明 Fe(II)对 NO3-的还原起抑制作用。 菌株 Paddy-1 进行 Fe(II)氧化生成的矿物是无定型 Fe(III)矿物，无法生成高结晶度的铁矿。 通过对全基因组进行测序，我们得知 Paddy-1 的存在许多 Fe(II)/Fe(III)转运蛋白（铁载体和铁透过酶），以及包括铁氧化还原蛋白、类黄酮、细菌铁蛋白和血红素在内的铁调节蛋白的基因。特别是细胞内拥有 c1、c2、c553 和 c556 等具有捕捉 Fe2+能力的细胞色素 c，这几个细胞色素 c 和已经报道的 Fe(II)氧化相关的蛋白非常相似。另外，我们发现菌株拥有完整的反硝化代谢功能基因链。所以我们推测 Fe(II)经过 Fe(II)氧化相关蛋白的传递后，被传递给硝酸盐还原酶而完成整个 Fe-N 代谢通路。 
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参考文献(略)

本文编号：84528