食品危害物丙烯酰胺及食品功能因子芝麻酚对细胞线粒体功能调控的分子机制
第一章 文献综述
1.1.1 线粒体基本结构与功能
线粒体的结构包括外膜（outer-membrane）、内膜（inter-membrane）、膜间隙（innermembrane）和基质（matrix），其中内膜会向基质折叠形成嵴（cristae）（Mathews et al.2000）。线粒体的外膜具有良好的通透性，多数小分子（小于 500 Da）可以完全渗透通过，大分子物质依靠膜上的转运体转运。膜间隙中的内容物组成与细胞质相类似，包括众多生化反应的底物、酶和辅助因子。其中，腺苷酸激酶、单磷酸激酶和二磷酸激酶等能量物质的氧化磷酸化所需要的激酶含量高。内膜具有高度选择性，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原型 NADH、氧化型 NAD+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型 NADPH，氧化型 NADP+)，同时也包括核苷酸都是不可渗透通过的。相应的内膜具有更多的转运体如核苷酸转运体等（Mathews et al. 2000）
线粒体消耗细胞内 95-98%的氧气，而这一过程是发生在呼吸链（电子传递链）细胞色素氧化酶即 complex IV 位点上，将其还原为 H2O （Cadenas 2004）。氧化磷酸化期间，电子在氧化还原反应中从电子供体转移到电子受体，并且提供能量将质子从基质泵入内膜空间，在内膜两侧形成了质子浓度梯度，所产生的势能便是电子传递链的驱动力。而当质子通过ATP合酶即complex V流回基质时，所产生的驱动能量将ADP合成为ATP（Cadenas 2004）。然而在电子传递过程中，有 2-3%的电子无法到达细胞色素氧化酶位点并从呼吸链的 complex I 即辅酶 Q 处泄露（Cadenas 2004）。电子泄露是非酶还原 O2的基础，并通过单电子的转移形成了自由基，包括：超氧阴离子 O2.–，和过氧化氢 H2O2。由于这些自由基会氧化电子传递链上的组成蛋白（失活）、三羧酸循环上的酶以及膜上的脂质最终导致线粒体的氧化应激，所以一些线粒体靶向的治疗手段是以通过抑制从辅酶 Q 处产生的电子泄露来减少氧化物和自由基的产生，保护线粒体不受氧化应激的损伤（Sheu et al.2006）。
除了电子传递链的电子泄露，线粒体还可以通过单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）产生过氧化氢（Cohen 1987）。单胺氧化酶是一种位于线粒体外膜上的酶，包括MAO-A 和 MAO-B 两种。单胺氧化酶是以包括 5-羟色胺（serotonin）、去甲肾上腺素（norepinephrine）、 -苯乙胺（ -phenyl-ethylamine）等膳食中的胺类和单胺类神经递质（mono-amine neurotransmitters）为底物的。由单胺氧化酶介导的反应副产物包括一些神经毒性物质如 H2O2、醛类物质（aldehydes）（Edmondson 2014）。
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二十世纪五十年代，Harman 提出的“free radical theory of aging”指出正常代谢产生的自由基可能是衰老的根本原因（Harman 1955）。二十世纪八十年代 Miquel 等人又将该理论进一步拓展，提出由积累性损伤导致的 mtDNA 的突变是人体衰老和一些退行性疾病的主要原因，而该衰老理论也变为“Mitochondrial theory of aging”（Miquel et al.1980）。除了衰老之外，线粒体参与了包括肥胖、代谢综合征、心血管疾病等许多疾病的发展过程。下面结合本研究内容，从神经退行性疾病和癌症两方面阐述疾病与线粒体功能之间的联系。
1.2.1 线粒体与神经退行性疾病
人的大脑组织每时每刻消耗能量巨大，故而中枢神经系统的正常运作十分依赖于线粒体的功能。许多神经退行性疾病都与线粒体失活包括：线粒体供能下降、线粒体产生自由基过高、线粒体动态平衡紊乱等相关（Lin and Beal 2006）。
阿兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）又称脑退化症，是一种由于脑中神经纤维纠结和老年斑块导致的持续性神经功能障碍。 淀粉样蛋白（ -amyloid protein，A ）的沉积可能是导致 AD 的根本原因。一些研究表明线粒体的失活与氧化应激均参与 AD的发展过程。在转染细胞和转基因动物中，过表达的淀粉样蛋白前提蛋白（precursoramyloid protein，APP）会阻塞线粒体蛋白转运机制，并引起线粒体失活、能量代谢功能受损。在 AD 病人和转基因鼠中， 淀粉样蛋白与线粒体基质中的乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）结合，引起线粒体氧化应激并损伤线粒体呼吸链。 淀粉样蛋白还可以与线粒体内一种促凋亡蛋白 HtrA2/Omi 结合并释放到细胞质中引起凋亡。AD 病人的海马组织中，与线粒体动态融合相关的 Drp-1，OPA1，Mfn1/2 等蛋白表达下降，而与线粒体分裂相关的 Fis1 表达却上升，表明 淀粉样蛋白通过增加线粒体分裂调控线粒体的动态平衡。并且在过表达 APP 的海马组织神经元中，线粒体聚集在细胞核周围，表明 淀粉样蛋白还会抑制线粒体的运输影响突触可塑性（Swerdlow 2011）。综上， 淀粉样蛋白的聚集会导致线粒体失活，进而引起细胞功能的紊乱，这可能是 AD 重要的发病机制。
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第二章 丙烯酰胺诱导 BV2 神经小胶质细胞凋亡与线粒体调控机制
近年来有报道称食品危害物丙烯酰胺诱导神经系统内的脂质过氧化水平升高，一些动物实验和临床研究也证明丙烯酰胺具有一定的神经毒性。丙烯酰胺可以诱导星形胶质细胞瘤细胞（U-1240 MG）、原代星形胶质细胞、神经母瘤细胞（SH-SY5Y）发生凋亡（Chen et al. 2013; Lee et al. 2014; Sumizawa and Igisu 2007）。近期研究表明丙烯酰胺的暴露还会损伤血脑屏障、损伤其分泌和转运功能（Yao et al. 2014）。然而，尚未有针对丙烯酰胺对小胶质细胞毒性及毒性机制的研究。
神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞是神经系统中功能最重要的三种细胞，如图 2-1 （Allen and Barres 2009）。星形胶质细胞最主要的功能是对神经元的支持与营养供给。而小胶质细胞是神经系统中最主要的免疫细胞。小胶质细胞会在多种外界刺激下激 活 ， 如 LPS ， 百 草 枯 ， 亚 乙 基 双 - 二 硫 代 氨 基 甲 酸 锰 （ manganeseethylene-bisdithiocarbamate）等 （Carvey et al. 2003; X-F Wu et al. 2005; Y Zhou et al.2005）。小胶质细胞的激活对神经系统而言是把双刃剑，既能对通过消除外来物质对神经系统所造成的伤害，也能因为过度激活产生过多的炎症因子对神经系统造成损害。如激活的小胶质细胞可以分泌髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO），其可以催化过氧化氢形成更高神经毒性的次氯酸（HClO），并进一步导致神经系统的组织损伤和病灶的炎症反应加剧 （Lefkowitz and Lefkowitz 2008）。
小胶质细胞的激活、炎症反应、凋亡过程均与线粒体功能有关。如 1.1.3.5 和 1.1.3.6所述，线粒体是调控细胞凋亡和炎症反应的中心：线粒体依赖的凋亡信号通路通过细胞色素 c 的释放和 caspase 通路激活下游的凋亡进程；线粒体调控着炎症因子的表达、炎症小体的形成，以及与炎症相关的通路信号分子 NF B、MAPK 等。所以在检测外源物质对小胶质细胞激活状态、凋亡进程的影响时，线粒体的功能是重要的生理指标。
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（1）研究丙烯酰胺对大鼠原代神经小胶质细胞和神经小胶质细胞系 BV2 细胞的毒性；
（2）研究丙烯酰胺诱导的线粒体功能失活与细胞生存/死亡信号通路之间的联系；
（3）研究丙烯酰胺对 BV2 细胞炎症反应的影响。
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2.3.1 细胞株
原代小胶质细胞分离自 SD 大鼠，分离方法简述如下：
处死大鼠后迅速分离脑组织后并置于冰浴的 HBSS 溶液中。剥离皮层部分，在胰酶的消化下，反复用玻璃棒研磨以分离胶质细胞。细胞在经过滤后，置于多聚赖氨酸预先铺好的培养瓶中。培养基为含 20% FBS 的 DMEM/F12 培养基。第一周隔天换液，第二周每周换两次液。两到三周后待细胞完全贴壁后，将培养瓶置于振荡器上连续震荡 4 h，上层悬液震摇下的即为原代小胶质细胞，仍然贴壁的为星形胶质细胞等其他胶质细胞。（可以通过后续的 GFAP 和 OX-42 染色分别区分星形胶质细胞和小胶质细胞）
BV2 细胞（小鼠小胶质细胞系），购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库, 培养基为含 10% FBS 的 DMEM 培养基，培养条件为 5% CO2、37°C。
2.3.2 主要试剂
丙烯酰胺（Acrylamide,ACR）、3（-4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、溴化乙锭（EB）、吖啶橙（AO），蛋白酶抑制剂/去磷酸化酶抑制剂（protease/phosphataseinhibitor cocktail）均购自美国 Sigma-Aldrich 公司；
线粒体膜电位探针 JC-1，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 购自中国江苏碧云天生物技术有限公司。
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3.1 引言.........................................................56
3.2 研究内容................................................... 56
3.3 材料与方法................................................. 56
第四章 芝麻酚诱导 HepG2 人肝癌细胞凋亡与线粒体调控机制 ..........72
4.1 引言........................................................ 72
4.2 研究内容.................................................... 72
第五章 芝麻酚对 HepG2 人肝癌细胞自噬的影响及线粒体的参与机制 ......85
5.1 研究背景.................................................... 85
5.1.1 自噬....................................................... 85
5.1.2 细胞自噬对凋亡的影响...................................... 85
第六章 芝麻酚与 DNA结合作用的研究
6.1.1 研究背景
天然小分子与生物大分子之间的相互作用是天然产物化学、食品营养、药理学、生物化学等多学科交叉领域的热点课题。研究与蛋白质、核酸等生物的相互作用，对探索功能性小分子在机体内的储存、运输、作用机制具有重要意义。
DNA 分子结构中由平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的沟区，是许多活性小分子的识别位点。小分子与 DNA 主要通过共价键、非共价键及剪切作用发生结合，其中大部分是以非共价键方式发生相互作用的。非共价结合主要通过三种作用模式（Kumar and Asuncion 1993）：（1）与荷负电的核糖-磷酸结构的静电结合作用；（2）与 DNA 沟区的作用；（3）嵌入到 DNA 堆积的碱基对之间。此外，还存在氢键、范德华力、疏水作用、瞬时偶极等较弱的作用力，这些作用力一起维系着DNA 特有的各种活性结构。许多具有抗癌、抗病毒等活性的小分子物质在生物体内的靶目标都是 DNA，它们通过与 DNA 结合，干扰 DNA 的复制和 RNA 的合成，，使肿瘤、病毒细胞遭受破坏（Montaner et al. 2005）。可见，通过深入研究小分子物质与 DNA 作用，不仅有助于从分子水平上理解 DNA 的结构特性、基因突变、疾病的来源、天然小分子的抗癌、抗病毒的作用机制、活性物质和小分子物质的体外筛选等方面都具有重要的意义。
6.1.2 研究的目的和意义
芝麻酚作为一种具有抗癌活性的小分子物质，其与 DNA 的作用机制尚不明确。本研究利用光谱法和分子模拟研究芝麻酚与 DNA 分子相互作用的类型、作用力，以揭示芝麻酚生物功效的分子机制。研究主要应用紫外与荧光光谱法研究了芝麻酚和 DNA 相互作用的结合常数、结合位点数、结合力及结合距离、淬灭机理等各种信息，利用圆二色谱、红外光谱及分子模拟研究芝麻酚和 DNA 相互作用的结合模式。这对于临床使用剂量及了解小分子的作用过程具有重要的意义。小分子与 DNA 结合的研究报道较少，目前也尚未有关于芝麻酚与 DNA 结合作用机理的研究，从结构变化合理地阐释了结合方式，这将对药物的合成与应用提供有价值的理论指导。
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第七章 结论、创新点与展望
本文以食品危害物丙烯酰胺和食品功能因子芝麻酚为研究对象，系统研究了两者对细胞内线粒体依赖性凋亡通路、线粒体能量代谢过程、氧化还原敏感的信号通路、线粒体自噬等相关的生理过程的影响。本文的研究内容和结果如下：
（1）丙烯酰胺可显著抑制 BV2 神经小胶质细胞系的细胞活力，并具有浓度依赖性。并且丙烯酰胺可诱导 BV2 细胞和大鼠原代细胞发生凋亡；进一步的试验表明，丙烯酰胺降低了线粒体膜电势和 Bcl-2/Bax 比值，增加了细胞色素 c 的释放，激活 caspase 通路，进而激活了线粒体依赖的内源性细胞凋亡通路。丙烯酰胺可通过调控 BV2 细胞内对氧化还原敏感的信号通路及转录调控因子，进而影响细胞的增殖、炎症与凋亡。丙烯酰胺抑制了细胞存活信号蛋白 Akt 的磷酸化，激活了细胞死亡和炎症信号 JNK 和 p38；丙烯酰胺增加了炎症转录调控因子 NF B 及其下游诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，进而增加了细胞 NO 的产量，表明丙烯酰胺具有促进炎症反应的作用；此外，丙烯酰胺处理增加了与细胞氧化还原相关的转录调控因子 Nrf2 的表达，但并未促进其向核内转移。
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参考文献（略）
本文编号：98571
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/98571.html
