胶孢炭疽菌杀菌剂抗药性的机制、检测技术及治理研究

发布时间：2016-08-20 06:10

1 文献综述

目前，炭疽病已经成为草莓种植区的主要病害，并且在许多国家发生。自1931 年[29]草莓炭疽病被首次报道以来，已有很多国家对该病的发生进行了报道，60 年代末日本在德岛县发现“芳玉”存在该病，同时，巴西、墨西哥、印度等国也有该病报道，80 年代该病迅速扩展蔓延[30]。比利时报道：即使采用杀菌剂进行防治，炭疽病菌引起的果实腐烂仍能容易的造成 25%的损失[24]。美国东南部炭疽病菌导致的根颈腐最高可造成 80%的经济损失，危害范围广泛[31]。在我国江苏、杭州、宁波、上海、建德、西藏等地都有草莓炭疽病普遍发生的报道，万瑶等调查表明杭州下沙和建德地区 7—9 月份草莓炭疽病的发病率为 30%左右[32]。草莓感染炭疽菌的症状主要表现为果实和根颈腐烂。匍匐茎和叶柄的症状主要表现为近黑色的病斑，纺锤形或椭圆形、稍凹陷，病斑可绕匍匐茎和叶柄一圈逐渐扩展，导致病斑以上部位叶片的枯萎和死亡，在高湿条件下，病部可见粉红色的黏质孢子堆，根冠发病时能导致整个草莓植株死亡，起初是叶片失去生机下垂，逐渐枯死，无病新叶不矮化、黄化或畸变，根部切面从内到外变红褐色，维管束不变色[28]。其他的症状包括芽腐、花腐、整个叶片上出现黑色叶斑及叶尖和叶缘出现不规则的叶斑。

.....

2 胶孢炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性

2.1 材料与方法

用于抗药性检测研究的68株草莓炭疽病菌 C. gloeosporioides分别采自浙江省临安市、建德市和诸暨市设施草莓上的炭疽病病样，每发病中心采集 1 个样本（发病短缩茎、匍匐茎和叶柄），单独存放人样品袋，带回实验室分离。采用组织分离法获得，即用解剖刀从病健交界处切取小块病组织数块大小约5mm×5mm，将病组织放入 1.5%次氯酸钠溶液中消毒 2min，再经 75%的乙醇中消毒 1min 左右，然后用灭菌水漂洗 3 次，除去残留的消毒剂，最后将其放在无菌吸水纸上吸去多余的水分来减少病组织附近出现的细菌污染，在含有链霉素和氨苄青霉素各 50μg/mL 的 PDA 板放 5 块病组织[85]。25℃培养箱中培养 4d，在菌落边缘挑取单菌丝顶端在 PDA 平板上继代培养 3～5 次，，得到纯化菌株。对纯化后的菌株观察其培养特征，7d 后用无菌水洗下孢子显微观察其形态特征。所有菌株于 4℃下保存于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面上备用。用于后面试验的葡萄炭疽病菌已由本课题组陈聃前面描述[46]。

2.2 结果与分析

所采集的草莓炭疽病菌对甲基硫菌灵已经产生了普遍的高抗药性，其中敏感菌株(Ben S)1个，频率为1.47%，高水平抗药性菌株（Ben HR）67个，频率为98.53%，没有检测到低水平抗性菌株(Ben LR)和中等抗性菌株(Ben MR) （表2.1，图2.1）。供试菌株中有 3 种表现型，分别为 Ben S（对甲基硫菌灵敏感），Ben R2（多菌灵.乙霉威双重抗药性菌株）。Ben R1（甲基硫菌灵高抗药性，但对乙霉威敏感）。在不同的温度（4℃、25℃和 34℃）影响下，三种表现型菌株（Ben S 、Ben R1 和 Ben R2）能够稳定表达，无温度敏感性变化（表 2.2）。

3 胶孢炭疽菌对吡唑醚菌酯的抗药性检测及机制研究................20

3.1 材料与方法......... 21
3.2 数据分析处理.............. 24
3.3 结果与分析.......... 24
3.4 讨论..................... 29
4 胶孢炭疽菌抗药性治理药剂的筛选......................32
4.1 材料和方法.............. 32
4.2 结果与分析............. 34
4.3 讨论.......... 39
5 胶孢炭疽菌及其抗药性的 LAMP 快速检测技术...........40
5.1 材料与方法............... 40
5.2 结果与分析..................... 42

5 胶孢炭疽菌及其抗药性的 LAMP 快速检测技术

5.1 材料与方法

胶孢炭疽菌是一种重要的植物病原菌，其分布广泛、寄主繁多[7,8]，侵染症状主要表现为叶片呈凹陷坏死斑，茎、花和果实枯萎腐烂，死苗等症状，可造成重要的经济损失。而在20世纪90年代后多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂被大量应用，在浙江葡萄和草莓中已经检测到普遍的高抗药性菌株[9,10]。因此，建立胶孢炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性的快速检测技术，用于炭疽病的防治及抗药性治理具有重要的意义。聚合酶链式反应（PCR）为动植物病原菌检测的重要方法，但需要较昂贵的仪器、试剂与耗材，后期的电泳检测也费时，致使这一技术很难在生产一线普及推广[76]。环介导等温扩增（Loop-mediated isthermal amplification, LAMP）技术是由Notomi等在2000年研发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法[78]，只需在65℃恒温条件下反应30 min，即可实现对目标片段进行的大量扩增。在反应中加入钙黄绿素(Calcein)，若颜色由橙黄色变为绿色荧光则说明其中存在被扩增的目标片段。本研究建立了可视化 LAMP 检测体系，为胶孢炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性检测提供了一种新的手段，同时可为胶孢炭疽菌潜伏侵染的检测研究提供参考，对于炭疽病害防治和抗病育种尤为重要。

5.2 结果与分析

恒温水浴 30min 后，观察 PCR 管中颜色变化，结果只以加了胶孢炭疽菌模板的反应管中，颜色由橙黄色变为荧光绿色，即发生了阳性反应。而以 ddH2O为模板的反应管颜色没有变化，仍为橙黄色，表明其为阴性反应（图 5.2-a）。进一步通过 2% 的琼脂糖凝胶电泳和 EB 染色观察，结果发现以胶孢炭疽菌为模板的阳性反应扩增产物出现了典型的 LAMP 梯形条带，而以 ddH2O 为对照的阴性反应中没有扩增条带(图 5.2-b)。说明引物、反应体系和条件符合可视化Tubulin-LAMP 反应。
......

6 全文结论

离体条件下测定了 DMIs 和 QoIs 类中的 5 种杀菌剂对 8 个胶孢炭疽菌菌株菌丝生长的抑制活性，由高到低依次为：咪鲜胺、苯醚甲环唑、戊唑醇、吡唑醚菌酯和嘧菌酯。筛选出咪鲜胺与吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑分别进行复配的两种药剂，并进行复配比例的筛选，试验中所有的比例配方对胶孢炭疽菌的增效系数（SR）都大于 0.5，未出现拮抗现象，其中咪鲜胺-吡唑醚菌酯（1:3）和咪鲜胺-苯醚甲环唑（1:5）表现出了最好的增效作用。建立了可视化的 LAMP 检测方法，Tubulin-LAMP 检测技术具有良好的特异性，不但能区分胶胞炭疽菌和其它常见病原真菌，并且能特异性检测出 BenR2 抗药型胶孢炭疽菌菌株。

.......

参考文献（略）

本文编号：98574