猬实再生体系的建立及其遗传转化研究

发布时间：2016-08-20 06:10

1 引言

猬实喜充分日照及排水良好的肥沃土壤，也能在干旱及瘠薄的土壤中生长，较为耐寒，在华北地区生长良好。猬实株丛姿态优美，开花期正值早春诸花齐放之后（即初夏百花凋谢之时），开花繁盛，白中带粉，可爱喜人；果实形如刺猬，夏秋成熟，，挂满枝头，观赏价值较高，是华北地区春夏季节重要的花灌木。园林应用采用孤植、丛植均美。多栽种于草坪种、山石旁、道路口和亭台楼阁周围，盆栽欣赏或作切花也非常别致。一直以来，因人类生产活动和猬实自身特性的影响，猬实自然群落分布分散，呈斑块状，野外生存面临巨大威胁，国家环境保护总局在 1987 年《中国珍稀濒危保护植物名录》中将其定为三级稀有保护植物。濒危植物是植物遗传育种的珍贵材料，一个物种就是一个基因库，是研究植物起源、进化的有力依据。目前猬实应用于园林栽植尚不普遍，但它是一种在城市园林绿化中极有发展前途并值得大量推广的观赏花木。猬实常采用播种、扦插、分株繁殖，利用组织培养方法进行繁殖的研究较少，该研究的目的就是找出影响猬实组培的主要因素，建立猬实的再生体系，以满足城乡园林绿化的需求，并进行种质资源保护。组织培养在猬实的化学诱变、基因遗传转化、优良品种繁殖等方面具有独特的价值和优势，可加速猬实的良种繁育进程。近些年，农杆菌介导的遗传转化和基因工程育种技术的发展，多是以组织培养为基础开展的。最近基因靶向剪切，定点敲除/敲入原理和技术研究，更为植物育种展示了无限的前景。木本植物育种周期长，通过组织培养结合这些新技术，可以大大缩短育种周期。完善猬实的组织培养技术可以加快品种培育速度，为培育新品种提供可靠的技术平台。
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1.1 忍冬科植物组织培养研究现状
忍冬科 18 属约 500 余种，我国 12 属约 300 余种。忍冬科植物观赏价值较高，锦带花属（如海仙花）、猬实属（猬实）、忍冬属（如金银木）、六道木属（如糯米条）、荚蒾属（如木绣球）和接骨木属（如接骨木）等都是常见的观赏植物。总的来说，对比草本植物，木本植物组织培养较为困难，离体培养成功率不高。并且关于木本植物离体培养的研究多集中在果树、经济类树种和少量林木，而对于园林观赏木本植物的组织培养研究较少。某些植物种类难以进行植株再生和遗传操作，亲缘关系很近而基因型不同的品种对组织培养的反应有很大差异。另外，简单的培养细胞会导致非表型和非遗传的变异等，这些都制约着其在品种改良中的应用。外植体接种到培养基上，一般先进行细胞脱分化，即原来已分化的细胞逐渐失去原来的分化状态，而进行细胞分裂，形成由一群薄壁细胞组成的愈伤组织或细胞团。愈伤组织经诱导分化的激素等物质刺激，经过再分化，从而形成不同类型的细胞、组织或器官，进而获得再生植株，这个过程就称为愈伤组织的诱导分化。不同来源的愈伤组织，在颜色、结构上都可能存在差异。它们的颜色可能是黄色或白色，它们的外观可能是光滑的或是粗糙的，它们的结构可能是致密的或是松脆的。一般而言以颜色鲜艳、生长旺盛、结构松脆型的愈伤组织为好。成熟细胞恢复分裂活性、向分生状态逆转和形成脱分化的愈伤组织的现象称之为脱分化。一般而言，外植体通常包含不同类型的细胞，因而脱分化形成愈伤组织，再生形成一个完整植株或植物器官的能力是异质的。对于一个已分化的细胞，表达其全能性的过程应该首先经历脱分化，而后再经历一个再分化的过程。再分化是指脱分化的细胞或组织在特定的条件下转变成各种不同细胞类型的现象。
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2 材料与方法

2.1 试验材料
所用材料一部分采自山东农业大学校园内，另一部分采自山东省泰安市泰山区红门路树木园。于 9~10 月采集当年生的成熟果实，净种阴干后装入牛皮袋中 4 ℃干燥保存。植株叶片和茎段于 4~5 月采取，随用随采。无菌叶片取自：种子经过催芽处理后，在无菌条件下发芽获得的试管苗叶片；灭菌茎段萌芽生长出的新叶。

2.1.2 主要培养基及试剂组织培养选择 
MS 培养基为基本培养基，碳源的选择以蔗糖 30 g/L；琼脂的浓度为8 g/L。生长素类植物生长调节剂：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）。细胞分裂素类植物生长调节剂：噻苯隆（TDZ）、6-苄基嘌呤（6-BA）、玉米素核苷（ZT）。YEP 液体培养基：蛋白粉 2 g，酵母粉 2 g，Na Cl 1 g。加水定容至 200 m L，调节p H 至 7.0。YEP 固体培养基：蛋白粉 2 g，酵母粉 2 g，Na Cl 1 g，琼脂粉 2 g。加水定容至 200m L，调节 p H 至 7.0。GUS 染色液的配制主要参照 Jefferson（1987）的方法。（1）配制 50m M 磷酸钠缓冲液（p H7.0）：A 液：称取 Na H2PO4·2H2O 3.12 g 溶于无菌蒸馏水，定容至 100 m L。B 液：称取 Na2HPO4·12H2O 7.7 g 溶于无菌蒸馏水，定容至100 m L。取 39 m L A 液与 61 m L B 液混合。（2）配制 X-Gluc 母液：称取 5mg X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯），溶于 1 m L DMF（二甲基酰胺）。（3）染色液配制：磷酸钠缓冲液 50 m M，0.1 % Triton X-100，K4 [Fe(CN)6] （亚铁氰化钾）5 m M，K3 [Fe(CN)6] （铁氰化钾）5 m M，X-Gluc 0.5 mg/m L。
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2.2 试验方法
用不同浓度的赤霉素处理，以达到破除休眠的目的。去除果皮后，将种子浸泡在浓度为 50、100、150、200、250、300 mg/L 的赤霉素中 24 h，流水洗净后播种。变温层积处理是用高温与低温交替进行催芽的方法。先用高温（15~25 ℃）后用低温（0~5 ℃)，通过变温模拟自然界层积的昼夜温差效应，使猬实种子在短时间内达到层积的效果。试验设定不同的变温周期及循环次数，观察其催芽效果。将种子用 5%的次氯酸钠（Na Cl O）溶液浸泡 5 min 进行消毒，蒸馏水冲洗 4~5 次。将消毒后的种子放在垫有脱脂棉和滤纸的培养皿中，置于恒温 25 ℃培养箱中催芽。每皿 30 粒种子为一个重复，每个处理 5 个重复。从播种第 7 天进行观察，并在每天固定时间记录种子萌发数，种子萌发以胚根达到种子长度的 1/2 为标志，如有霉烂的种子及时清除。计算在 30 天内的发芽势及最终发芽率。发芽率（%）= 发芽达到高峰期时正常发芽种子粒数/供检种子总数×100 %发芽势（%）= 发芽达到高峰期时正常发芽种子粒数/供检种子总数×100%
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3 结果与分析..........17
3.1 猬实的播种繁殖.........17
3.2 再生体系的建立.........18
3.3 农杆菌介导的遗传转化.......26
4 讨论............29
4.1 种子休眠的破除.........29
4.2 再生体系的建立.........30
4.2.1 植物激素与再生体系........30
4.2.2 愈伤组织来源与芽分化..............31
4.2.3 温度处理与芽分化............32
4.2.4 褐化现象........32
4.2.5 生根培养........33
4.3 遗传转化...........33
4.3.1 预培养时间..............34
4.3.2 农杆菌浓度和侵染时间..............34
4.3.3 乙酰丁香酮浓度......35
4.3.4 共培养时间..............35
4.3.5 抗生素浓度..............35
5 结论............36

4 讨论

4.1 种子休眠的破除

硬实是植物界存在的普遍现象，由于对胚生长的机械限制，导致种子休眠，而高温浸种及酸蚀是解除许多硬实种子休眠的常用方法。高温浸种可以软化种皮，去掉种皮表层的蜡质和油脂，提高透性和浸出种子内发芽抑制物，促进萌发。温度较低，软化效果较差，温度过高，容易烫伤种子。因此最佳处理为 80 ℃热水浸种后，温水浸种 48 h。猬实有坚硬果皮包被，浓硫酸处理果实 20 min 后，萌发率大幅提高，说明猬实果皮和种皮存在机械束缚，经过短时间酸蚀处理，种壳变薄，增加透性，促进发芽且酸蚀处理后，果皮容易去除，方便播种；但酸蚀时间过长，很容易使种子受伤，影响种胚萌发。种子的休眠和萌发受植物体内生长促进物质与抑制物质的平衡控制，在休眠种子中脱落酸含量很高，阻碍了营养物质的吸收。赤霉素能促使营养物质转化成可溶状态，同时也促进生长素的合成，从而打破种子休眠而促使萌发。试验结果表明，外源赤霉素是破除猬实种子休眠的关键因素，适宜浓度的外源赤霉素能更好提高催芽效果。变温处理能够部分替代赤霉素处理的作用，适用于大量样本播种。变温周期 6 小时 15 次循环，发芽率、发芽势均到达最高。变温处理通过模拟自然条件下的昼夜温度变化，调控种子内部激素代谢水平，温度可控性更强，因此催芽时间大大缩短。机械束缚、抑制物质和胚休眠是阻碍猬实种子萌发的主要因素，激素调节是破除休眠关键因素。试验以 80℃热水烫种后，温水浸种 48 h 或用 98 %浓硫酸酸蚀 20 min，然后用 100 mg/L 赤霉素浸种 24 h，最终猬实种子发芽率超过 70 %，发芽势达到 40 %以上。人工变温处理能较好替代赤霉素处理的作用，最适为变温周期 6 小时，经过 15 次循环后播种。

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结论

（1）猬实的播种繁殖80 ℃热水处理后温水浸种 48 h 或用 98 %的浓硫酸处理 20 min，最后用 100 mg/L的赤霉素处理 24 h 能有效提高猬实种子萌发的发芽率和发芽势，是高效的催芽手段。变温周期 6 h，处理 15 个循环，能较好替代赤霉素处理的作用。
（2）愈伤组织培养选取无菌苗叶片为外植体，愈伤诱导培养基选择：MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L较为适宜。
（3）离体叶片芽再生多种处理结合，分阶段培养能使愈伤组织获得高芽效分化：先在高细胞分裂素浓度的芽分化培养基上（MS+6-BA 4.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L）培养一周；之后于不添加激素的 MS 培养基上进行一周的 4 ℃低温培养，扣除生长激素；最后转接到低细胞分裂素的芽分化培养基上（MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L + IBA 0.1 mg/L）。
（4）生根培养最适宜生根培养基是 MS+NAA 0.2 mg/L。
（5）遗传转化以叶片愈伤组织为受体，预培养 4 d，以浓度为 OD600=0.6 的菌液侵染 40 min，并附加乙酰丁香酮 100 μmg/L 共培养 3 d，能获得较理想的转化效果。50 mg/L 的卡那霉素和400 mg/L 头孢霉素能起到很好的筛选效果。对转基因外植体进行 GUS 染色，证明 GUS基因已整合到猬实基因组中。
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参考文献(略)

本文编号：98575