盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清的制备及鉴定

发布时间：2024-12-17 23:51

　　 病程相关蛋白(PRs)在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)来自盐穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L-1NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制,该研究通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白制备特异性的HcPR10多克隆抗体。并采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21诱导表达,通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白,分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明:成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10;正交结果显示诱导温度27℃,诱导转速200 r·min-1,IPTG浓度0.7 mmol·L-1,诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白; ELISA检测抗H...

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图2 BL21-pET28a-Hc PR10的原核诱导表达及重组蛋白His-HcPR10的可溶性检测

高效的蛋白表达系统是研究蛋白结构、定位及功能的基础。本研究的核心目的是纯化目的蛋白，制备效价高、特异性好的盐穗木病程相关蛋白HcPR10的抗血清。大肠杆菌是最常用的原核表达系统，具有遗传背景清楚、遗传稳定、表达量高、成本低廉、表达产物易纯化及使用范围广等优点(Nuc&Nuc,2....

图3 不同诱导条件对BL21-pET28a-Hc PR10可溶性融合蛋白表达量的影响

图2BL21-pET28a-HcPR10的原核诱导表达及重组蛋白His-HcPR10的可溶性检测图4His-HcPR10重组蛋白的大量诱导表达及纯化

图4 His-HcPR10重组蛋白的大量诱导表达及纯化

图3不同诱导条件对BL21-pET28a-HcPR10可溶性融合蛋白表达量的影响图5HcPR10抗血清效价及特异性检测

图5 Hc PR10抗血清效价及特异性检测

图4His-HcPR10重组蛋白的大量诱导表达及纯化在最佳条件下诱导表达重组蛋白，用Ni2+亲和层析获得纯化的目的蛋白，免疫小鼠获得HcPR10抗血清，ELISA检测结果显示制备的HcPR10抗血清效价达1∶243000。抗体对抗原蛋白的专一性是抗体应用的关键，本研究提取....

本文编号：4016721