异源表达来自Enterobacter cloacae ⅡT-BT08中EcHydA对于Klebsiella oxytoc

发布时间：2023-02-17 20:58

　　在当今全球气候变暖以及化石燃料消耗大量增加的背景下,氢气作为一种可再生、零污染和高效的清洁能源而受到大量的关注。在不同的制氢方式中,生物产氢由于生产成本最低、原料来源丰富和环境污染小的特点,从而成为能源行业制氢研究的热点。在生物制氢的发展中,氢酶是特别重要的一环,氢酶是一种含金属中心的氧化还原酶,在自然界广泛存在,氢酶的特点是能够可逆地催化H2的氧化还原(2H++2e-→H2),因此在工业产氢以及生物氢能利用方面,氢酶都是氢能技术的核心关键研究方向之一。有研究表明了Enterobacter cloacae IIT-BT 08的[Fe-Fe]氢酶 EcHydA 蛋白的同源表达可以改善该菌株的发酵产氢,Klebsiella oxytoca HP1是一株具有高效产氢特性,生长迅速,以及是一种好氧产氢特性的菌株,在暗发酵产氢工业具有良好的发展前景。本研究的总体目标是将来源于E.cloacae IIT-BT 08的[Fe-Fe]氢酶基因EchydA转入K.oxytoca HP1,以进一步增强K.oxytoca HP1菌株的发酵产氢量。本研究全基因合成了来源于E.cloacae IIT-BT08的...

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摘要
Abstract
前言
    1.1 生物制氢
    1.2 生物产氢分类
        1.2.1 光解水制氢
        1.2.2 光合细菌产氢
        1.2.3 暗发酵产氢
        1.2.4 光-暗联合发酵产氢
    1.3 生物制氢面临的挑战
    1.4 氢酶
        1.4.1 氢酶的种类
            1.4.1.1 [Ni-Fe]氢酶
            1.4.1.2 [Fe-Fe]氢酶
            1.4.1.3 [Fe]氢酶
    1.5 Klebsiella oxytoca HP1产氢概况
    1.6 新型[Fe-Fe]氢酶概况
    1.7 研究的内容与意义
2 实验材料
    2.1 菌株和质粒
    2.2 克隆引物
    2.3 培养基
    2.4 K.oxytoca HP1菌种的保种与感受态制备
        2.4.1 K.oxytoca HP1菌种的保种
        2.4.2 K.oxytoca HP1菌种的感受态制备
    2.5 试验药品与试剂
    2.6 试验仪器
3 试验方法
    3.1 蛋白结构分析
    3.2 重组菌株的构建
        3.2.1 重组质粒的构建与转化
        3.2.2 双酶切验证
    3.3 氢酶蛋白的诱导表达与检测
        3.3.1 氢酶蛋白的诱导表达
        3.3.2 SDS-PAGE检测
        3.3.3 Western Blot检测
    3.4 产氢能力的分析
    3.5 氢酶活性分析-
    3.6 RT-qPCR分析
    3.7 代谢物分析
    3.8 添加[Fe-S] cluster的hydA的相关分析
        3.8.1 [Fe-S]-hydA重组菌的构建
        3.8.2 [Fe-S]-hydA-pGEX-4T-1重组质粒转化
        3.8.3 双酶切验证
        3.8.4 [Fe-S]-蛋白的诱导表达与检测
        3.8.5 [Fe-S]-HydA重组菌株产氢相关分析
4 实验结果
    4.1 EchydA基因与蛋白结构分析
    4.2 氢酶基因原核表达载体的构建
    4.3 菌种鉴定
    4.4 诱导重组蛋白的异源表达与Western Blot检测
    4.5 体内产氢能力的分析
    4.6 不同底物下重组菌的产氢分析
    4.7 氢酶活性分析
    4.8 氢酶转录水平的表达分析
    4.9 产氢相关代谢物特征分析
    4.10 [Fe-S] -HydA的产氢分析
5 讨论
    5.1 EchydA基因的分析
    5.2 EcHydA氢酶蛋白的异源表达对产氢的影响
    5.3 基因表达水平分析
    5.4 副产物水平分析
    5.5 [Fe-S] cluster的添加后分析
6 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
附录
致谢



本文编号：3744573