还原型谷胱甘肽参与肠杆菌CZ-1一甲基砷耐性与还原的分子机制研究

发布时间：2023-06-03 17:29

　　砷是一种广泛存在的有毒类金属元素。环境中常见的砷包括无机三价砷As(Ⅲ)、五价砷As(Ⅴ)、以及多种甲基砷化合物。为了应对砷化合物的毒性胁迫,生境中的微生物进化出了多种解毒策略,包括:(1)As(Ⅴ)的还原外排与直接外排机制;(2)As(Ⅲ)的外排、氧化及甲基化机制。砷的甲基化作用是指利用甲基供体向无机砷化合物的砷原子上不断添加甲基的过程,该过程的产物包括五价的一甲基砷MAs(Ⅴ)、二甲基砷DMAs(Ⅴ)、三甲基砷氧化物TMAs(Ⅴ)O以及胂化氢TMAs(Ⅲ)气体等。其中的MAs(Ⅴ)是环境中砷甲基化作用的常见产物,在土壤和水体中都广泛存在。因其对人体毒性较低且具有除草的作用曾被广泛的用于农业。虽然MAs(Ⅴ)毒性远低于无机砷,但依然具有潜在的环境风险。MAs(Ⅴ)在土壤中过度施用会抑制水稻生长、影响水稻生殖和籽粒发育,还会在水稻根茎叶和籽粒中积累,实现砷从土壤进入植物进入食物链,威胁生态系统和人类健康。另外,MAs(Ⅴ)还会在微生物的作用下发生转化,还原成剧毒三价一甲基砷MAs(Ⅲ),MAs(Ⅲ)既可以脱甲基化为高毒的As(Ⅲ),又可以进一步甲基化,在环境中生成DMAs(Ⅴ)(可以诱...

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
部分符号及缩略语说明
第一章 文献综述
    1.1 砷的来源和砷污染的现状
    1.2 砷的形态、毒性及危害
    1.3 微生物的砷解毒机制
        1.3.1 砷的外排
        1.3.2 砷的氧化还原
        1.3.3 砷的甲基化
    1.4 五价一甲基砷的来源和微生物转化
        1.4.1 五价一甲基砷的来源
        1.4.2 五价一甲基砷的微生物转化
    1.5 本研究的意义、研究内容及技术路线
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 研究内容
        1.5.3 技术路线
第二章 ENTEROBACTER SP. CZ-1中MAs(Ⅴ)耐性基因的克隆与功能验证
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验菌株、质粒、培养基及缓冲液
        2.2.2 Enterobacter sp. CZ-1和E coli Trans 5α的MAs(Ⅴ)耐性分析
        2.2.3 构建基因文库筛选Enterobacter sp. CZ-1中参与MAs(Ⅴ)耐性的基因
        2.2.4 表达gshA对E.coli Trans 5α MAs(Ⅴ)耐性的影响
        2.2.5 gshA和gshB基因敲除菌株的构建
        2.2.6 分别敲除gshA和gshB对Enterobacter sp. CZ-1 MAs(Ⅴ)耐性的影响
        2.2.7 胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量的测定
        2.2.8 GSH的添加对Enterobacter sp. CZ-1及其突变体MAs(Ⅴ)耐性的影响
        2.2.9 数据处理
    2.3 结果与分析
        2.3.1 Enterobacter sp. CZ-1与E.coli Trans5α的MAs(Ⅴ)耐性间存在巨大差异
        2.3.2 克隆Enterobacter sp. CZ-1体内参与MAs(Ⅴ)抗性的基因
        2.3.3 异源表达gshA基因可提高E.coli Trans 5α胞内GSH的含量
        2.3.4 异源表达gshA基因可赋予E.coli Trans 5α更强的MAs(Ⅴ)耐性
        2.3.5 GSH参与Enterobacter sp. CZ-1的MAs(Ⅴ)解毒过程
        2.3.6 添加GSH可恢复ΔgshA和ΔgshB突变体的MAs(Ⅴ)耐性
    2.4 本章讨论
    2.5 本章小结
第三章 还原型谷胱甘肽介导ENTEROBACTER SP. CZ-1 MAs(Ⅴ)解毒作用的机制研究
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料与试剂
        3.2.2 Enterobacter sp.CZ-1 MAs(Ⅴ)还原能力的测定
        3.2.3 敲除gshA和gshB基因对Enterobacter sp. CZ-1 MAs(Ⅲ)耐性的影响
        3.2.4 研究内源性GSH对Enterobacter sp. CZ-1 MAs(Ⅴ)还原能力的影响
        3.2.5 检测异源表达基因对E. coli Trans 5α MAs(Ⅴ)还原能力的影响
        3.2.6 GSH对菌株胞内砷含量的影响
        3.2.7 研究内源性GSH对Enterobacter sp. CZ-1胞内活性氧水平的影响
        3.2.8 砷形态与总量的分析方法
        3.2.9 数据处理
    3.3 结果与分析
        3.3.1 GSH参与了Enterobacter sp. CZ-1介导的MAs(Ⅴ)还原过程
        3.3.2 GSH合成途径并未参与Enterobacter sp. CZ-1体内MAs(Ⅲ)的解毒过程
        3.3.3 异源表达gshA基因可赋予E. coli Trans 5α更强的MAs(Ⅴ)还原能力
        3.3.4 内源性GSH对Enterobacter sp. CZ-1和E coli Trans 5α胞内砷含量的影响
        3.3.5 内源性GSH可稳定Enterobacter sp. CZ-1胞内活性氧水平
    3.4 本章讨论
    3.5 本章小结
第四章 全文总结及创新点
    4.1 全文总结
    4.2 本研究创新点
    4.3 展望
参考文献
附录一 实验用分子生物学试剂
附录二 YQAA基因序列
附录三 GSHA基因序列
附录四 POSGM质粒序列
附录五 GSHB基因序列
致谢
攻读学位期间取得的学术成果目录



本文编号：3829735