棉花GhMADS43基因的克隆及酵母自激活分析

发布时间：2021-08-20 15:18

　　为探索棉花GhMADS43基因在茎尖和花分生组织发育过程中的机理,从棉花中克隆了MADS-box家族中GhMADS43基因,并对该基因进行表达分析和酵母自激活分析,以期利用酵母双杂交筛选GhMADS43的互作蛋白质。对棉花中GhMADS43基因进行克隆及组织特异性表达分析,结果显示,GhMADS43基因全长696 bp,编码231个氨基酸,与其他植物中编码FUL蛋白的基因亲缘关系相近。由特异性表达分析可得,GhMADS43基因在根和顶芽中表达量较高;对2种不同果枝材料进行不同顶芽发育时期的表达分析表明,该基因在无限果枝材料中棉所50五叶期和六叶期的表达量显著高于一式果枝材料早铃1号。将该基因构建到酵母诱饵载体pGBKT7,得到pGBKT7-GhMADS43诱饵表达载体。重组质粒转化酵母Y2HGold菌株后,在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落变蓝。利用不同浓度的3-AT对其进行筛选发现,该基因不能在三缺培养基SD/-Trp/-His/-Ade中生长,表明该基因不具有自激活活性。构建好诱饵表达载体后,... 

【文章来源】：华北农学报. 2020,35(06)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

GhMADS43基因克隆(A)与蛋白进化树分析(B)

组织特异性表达模式分析得出,GhMADS43基因在棉花的根和顶芽中优势表达,在成熟的花、纤维和胚珠中表达量显著降低(图2-A)。选取一式果枝早熟棉早铃1号和无限果枝早熟棉材料中棉所50从四叶展平时期至七叶展平时期的茎尖分生组织样品进行表达分析。结果表明,从五叶期开始GhMADS43基因在无限果枝中棉所50中的表达量高于一式果枝早铃1号,随着取样时间的推移,在中棉所50的六叶期和七叶期,GhMADS43基因的表达量显著高于早铃1号(图2-B)。2.3 GhMADS43基因诱饵载体的构建和鉴定

将上述构建好的诱饵载体和阳性对照pGBKT7-53分别转化至酵母菌株Y2HGold 中,待生长3～5 d后挑取2 mm左右的酵母单克隆在SD/-Trp缺陷培养基中培养过夜,并进行菌液PCR,PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图(图4-A)所示,诱饵重组质粒和阳性对照质粒转化后酵母菌落PCR产物条带大小与目标基因大小一致,说明重组诱饵质粒载体pGBKT7-GhMADS43和阳性对照质粒pGBKT7-53转化酵母成功。缺陷固体培养结果表明,转有重组诱饵载体在SD/-Trp平板上和转有对照的平板上菌落密集程度相似,生长正常,菌落大小均介于2～3 mm(图4-B)。重组诱饵质粒pGBKT7-GhMADS43和阳性对照质粒pGBKT7-53的菌液过夜培养后,OD600的检测值分别为1.002和1.121,均超过标准值0.8,说明重组诱饵蛋白对酵母菌Y2HGold 生长无毒性,可进行自激活活性检测。图4 诱饵载体转化酵母PCR检测(A)和毒性检测(B)

【参考文献】：
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