野生大豆GsPP2CA和GsPKA对GsSnRK1.1蛋白活性的调控

发布时间：2023-08-11 18:32

　　为了明确GsSnRK1.1蛋白激酶在野生大豆生长发育中的具体调控机制,该研究利用酵母二元杂交技术发现了蛋白激酶GsSnRK1.1的互作蛋白GsPP2CA和GsPKA,利用原核表达系统对GsSnRK1.1、GsPP2CA和GsPKA进行了表达和纯化用于Pull-down和体外磷酸化分析,并在酵母中研究了GsPP2CA和GsPKA对GsSnRK1.1蛋白活性的调控功能。结果表明:(1)GsSnRK1.1与GsPP2CA和GsPKA具有物理互作关系,Phos-Tag和pPKDsub特异性磷酸化抗体检测发现,GsSnRK1.1的Thr176磷酸化可以被蛋白磷酸酶GsPP2CA去磷酸化,GsPKA可能会磷酸化GsSnRK1.1的其他潜在磷酸化位点,进而竞争性抑制GsSnRK1.1的Thr176位点的磷酸化水平。(2)将这些基因回补进入酵母ARY330(-snf1/-reg1/-sit4)突变株系中,发现共转化GsSnRK1.1和GsPP2CA或GsPKA的转化子可在非葡萄糖碳源和高葡萄糖碳源的选择培养基上正常生长,GsPP2CA、GsPKA可以替代Reg1和Sit4降低GsSnRK1.1过度磷酸...

【文章页数】：10 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 试验材料
    1.2 方 法
        1.2.1 cDNA合成及PCR扩增
        1.2.2 PCR产物的克隆、鉴定与载体构建
        1.2.3 序列比对和保守结构域三维结构分析
        1.2.4 酵母双杂交试验
        1.2.5 融合蛋白的原核表达与蛋白纯化
        1.2.6 GST-pull down实验
        1.2.7 蛋白质磷酸化实验
        1.2.8 酵母缺失突变体的回补
2 结果与分析
    2.1 GsPP2CA、GsSnRK1.1及GsPKA基因全长的获得
    2.2 GsSnRK1蛋白的保守结构域分析
    2.3 GsPP2CA、GsPKA与GsSnRK1.1互作分析
    2.4 GsPP2CA、GsPKA对GsSnRK1.1磷酸化水平的调控
    2.5 GsPP2CA、GsPKA分别与GsSnRK1.1基因共同转化回补缺失基因的ARY330酵母
3 讨 论



本文编号：3841543