PCR法测量硅藻SSU基因于溺死鉴定的运用研究

第一章引言

水或其他液体堵塞呼吸道，出现呼吸障碍而发生机械性死亡称为溺死. 据统计，每年全世界有14万人溺死[2]。我国沿海、沿江地区溺死的案件也很多，据统计，溺死尸体约占法医尸体检验的20%。珠江三角洲地区河道水网密集，每年发现的水中尸体达1000多具。溺死是由于大量液体进入呼吸道所引起的窒息死亡。在江河湖海中发现的尸体绝大多数属于意外溺水死亡，但也部分为自杀或他杀，还有部分是死后抛尸入水伪造意外溺水身亡，因此水中尸体可能与刑事案件相关，必须进行法医学鉴定。确定生前入水和死后入水是解决此类案件的关键。据调查，每年全世界因溺死导致死亡的人数达到3.5/10万，对于未成年人，溺死排在意外死亡原因的第二位，因此对水中尸体死因的正确鉴定直接关系到尸体检验的质量和案件的定性。对于新鲜的水中尸体，可通过体表改变、内部器官征象、组织病理学检验以及左右心腔内血液成份的不同等进行溺死鉴定。但是，法医学实践中遇到的水中尸体大部分已腐败或髙度腐败，甚至已经白骨化，这类尸体的各种溺死征象已不存在，死因诊断是国际法医学界公认的难题。此时往往需要通过一些辅助检测方法来诊断溺死，其中相对成熟的方法是桂藻检验法（主要包括光镜下、电镜下形态学观察和计数)。硅藻细胞壁含无结晶的不易被破坏的含水桂酸盐（Si02.H20),能对外界环境变化有较强的抵抗力，有实验表明进入肺脏内的硅藻较少受到腐败等因素的影响，因此桂藻检测成为诊断溺死的重要辅助手段之一。
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第二章PCR-Agarose电泳检测桂藻SSU基因方法建立

2.1材料
于冬季，在南沙虎门大桥处，将生前溺死组实验兔置笼中，沉入海水下0.5m5s后提出水面10s,再重新沉入相同海水深处，重复上述步骤直致实验兔溺死，死后在水下0.5m处浸泡24h;死后入水组采用空气栓塞法处死后’置于相同海水深度浸泡24h后取出；对照组釆用空气栓塞法处死后不做任何处理。提取各组兔子肺、肝、肾边缘部位组织置于一40°C冰箱保存。提取一份溺死地点水样l00Ml。

2.2方法
对60只实验动物的组织脏器用重蒸水反复冲洗，去除组织外的包膜，分别在不同组织的边缘部位取材，用洁净的眼科剪将组织剪碎至勻装，取适量上述组织分别置入不同的洁净15ml eppendorf管中，在eppendorf管中加入O.Olmol/LTris-Hcl缓冲液10ml后，分别加胰蛋白酶于不同管中使其浓度为20mg/ml，置5(rC恒温箱内6h后观察，待液体近透明时，12 OOOrpm离心30min后，缓慢取出离心管，用洁净的吸管吸去上层上清液（极力避免震荡），底层含有硅藻，用于下游实验。将冰箱内的桂藻水样及用于阴性对照的非桂藻水样取出，解冻后上次混勾数次，用洁净的吸管吸取2ml水样置于洁净的离心管中，12 OOOrpm离心30min后，缓慢取出离心管，用洁净的吸管吸去上层上清液（极力避免震荡)，底层含有桂藻，用于下游实验。制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50 ml,)：称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml,(50inl)lxTAE,瓶口倒扣小烧杯或用锡纸将锥形瓶瓶口封住，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，核酸染色剂。胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位I并在固定位置放好梳子。将冷却到65°C左右的琼脂糖凝胶液混勾小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展幵，直到整个玻璃板表面形成均勻胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加IxTAE电泳缓冲液至没过胶板l-2mm为止。

第三章PCR-CE法检测硅藻SSU基因 ......18
3.1材料............ 19
第四章PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因 ...........29
4.1材料........ 31
 4.2方法.........32
全文小结 ........40

第四章PCR-DHPLC法检测桂藻SSU基因

4.1材料
20只溺死实验动物的肝、肾、肺组织已在上述实验中提取并保存于-4(rc冰箱；10例溺死诊断阳性的人体器官组织检材由广州市刑事科学技术研究所提供；对照样本：广州珠江段5种最常见桂藻样本(小环藻，直链藻，，菱形藻，针杆藻,舟形藻）由中国科学院水生生物研究所提供;实验动物溺死地点水样100ml己在上述实验中提取并保存。

4.2方法
对10例溺死诊断阳性的人体组织器官和溺死动物的组织器官用重蒸水反复冲洗，去除组织外的包膜，分别在不同组织的边缘部位取材，用洁净的眼科剪将组织剪碎至勾衆，取适量组织置于不同的洁净15inl eppendorf管中，在eppendorf管中加入Tris-Hc缓冲液10ml后，分别加胰蛋白酶于不同管中使其浓度为20nig/ml，置恒温箱内6h后观察，待液体近透明时，12OOOrpm离心30mm后，缓慢取出离心管，用洁净的吸管吸去上层上清液（极力避免震荡)，底层含有桂藻，用于下游实验。将冰箱内的硅藻水样及溺死地点水样取出，解冻后上次混勾数次，用洁净的吸管吸取2ml水样置于洁净的离心管中，12 OOOrpm离心30min后，缓慢取出离心管，用洁净的吸管吸去上层上清液（极力避免震荡)，底层含有硅藻，用于下游实验。通过使用Transgenomic公司DHPLC检测仪自带的Navigator软件包和斯坦福大学提供的在线软件 DHPLC Melt Program可对所有扩增片断的检测温度和分离梯度进行预测，根据预测的结果选择最佳的检测温度和分离梯度，在该检测温度下要求片断的大部分区域处于50%?99%的双链状态。在对DHPLC的检测温度和梯度进行实际摸索。
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全文小结

本研究采用LAURA㈣]等报道的引物扩增硅藻SSU基因，主要解决了以下几个问题：1、动物实验显示，生前溺死组桂藻检出率明显高于死后入水组和陆地死亡组(p<0.05).证明通过PCR检测硅藻SSU基因可有效区分生前溺死和死后入水。2、PCR-DHPLC法检验桂藻种类较微波消解法阳性率高（p<0.05),能减小误差和减少工作量，特别适用于桂藻含量少，传统法不易检出的样本。3、PCR-DHPLC法不仅可以检出硅藻，还可检验PCR产物构象，为判断溺死人体脏器内桂藻种属与溺死地点桂藻种属是否相同提供依据，可为溺死地点推断提供更多信息。4、PCR-CE法检验桂藻具有灵敏度高、特异性强等优点，且易推广应用，为同时检测多种浮游生物提供新思路。
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参考文献（略）