ATP-Lon 蛋白酶在稻瘟菌和疏绵状菌中的功能研究

发布时间：2016-10-08 07:13

第 1 章 前言

稻瘟病是水稻的四大重要病害之一，通过田间鉴别可知，它可对水稻各部分造成危害，在其整个生育期均可发生，主要危害叶片、茎秆、穗部[6,7]（图 1.1）。田间观察感染稻瘟病的水稻可见，在苗期，水稻发病后株体变成黄褐色直至枯死，但不形成明显病斑，当周围环境潮湿时，可在叶子表面观察到青灰色霉菌。依据气候条件和品种抗病性不同，稻瘟菌产生的病斑分为四种类型：慢性型病斑、急性型病斑、白点型病斑和褐点型病斑。 稻瘟病菌（Magnaporthe  oryzae）是真菌性病害，其有性世代属子囊菌亚门真菌，，属于异宗配合，基部稍膨大，淡褐色，向上色淡，顶端曲状，上生分生孢子。分生孢子无色，洋梨形或棍棒形、单倍体的丝状真菌，稻瘟菌的分生孢子梗不分枝，3-5 根丛生，具 2-8 个隔膜，常有 1-3 个隔膜，萌发时两端细胞立生芽管，芽管顶端产生附着胞。 

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第 2 章 稻瘟菌 ATP-Lon 蛋白酶（MAP2）功能研究

2.1   实验材料

QL-901  漩涡混合器、GL-3250  型电热磁力搅拌器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；PB-10 型 pH 计（Sartorius Group，Germany）；BS 224S  电子分析天平（Sartorius Group，Germany）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；SPX-2508-Z 型光照生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；WP-UP-Ⅱ-20 型超纯水仪（四川沃特尔水处理设备有限公司）；立式自动压力蒸气灭菌器（厦门致微仪器有限公司）；HZQ-F160 双层振荡培养摇床（太仓市毫诚实验仪器制造有限公司）；  MDF-U3386s  超低温冰箱（Pana Sonic，Japan）；Galanz  微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司）；恒温混匀仪（Eppendorf，Germany）；D-37520  小型台式离心机（Thermo，Germany）；PTC 200 PCR 仪（Bio-Rad Laboratories，INC，USA）；UV-2550  型分光光度计（Shimadzu，Kyoto，Japan）；Power PAC 200  电泳仪（Bio-Rad Laboratories，INC，USA）；Champ Gel 5000  数码凝胶成像分析系统（北京赛智创业科技有限公司）；光学显微镜（Nikon 80i，Japan）；DS126271  数码照相机（Canon Inc.，Japan）；7500 Real time PCR system（Applied Biosystems，Forest City，CA，USA）；

2.2   研究方法

稻瘟菌 RNA 提取方法根据 Trizol reagent 说明书进行，具体操作步骤如下： 1、实验器材的准备：在 RNA 提取前，事先准备好灭过菌的 RNase-free  EP管、小研棒、枪头，0.1%DEPC 水，各步操作在通风橱中进行。 2、收集 CM 液体培养基中培养 4 d 的约 0.1 g 菌丝于 1.5 mL RNase-free EP管中，盖上 EP 管盖，将 EP 管迅速放入液氮中约 1 min，用镊子取出 EP 管，迅速打开 EP 管盖，用事先经液氮冷冻过的小研棒充分研磨菌丝至粉末状。 3、研磨完毕后，立即加入 1 mL Trizol 1 mL，用力震荡充分混匀，然后室温静置 5 min。 4、5 min 后，4 ℃，8500 rpm  离心 5 min。

第 3 章  疏绵状嗜热丝孢菌 Mlon 和 Plon  基因的获得及生物信息学分析 .......... 53 

3.1   材料与方法... 53
3.2   结果与分析........... 54
3.3   讨论............. 65 
第 4 章  疏绵状嗜热丝孢菌中 Mlon 和 Plon  基因的敲除、互补及 Mlon 和 Plon 蛋白的亚细胞定位... 67 
4.1   实验材料............... 68
4.2   研究方法........................ 71
4.3   结果与分析...... 83
第5章Mlon和Plon基因在疏绵状嗜热丝孢菌生长发育及逆境自我保护中的功能分析............... 93
5.1   实验材料................ 93
5.2   研究方法........... 94

第 5 章 Mlon 和 Plon 基因在疏绵状嗜热丝孢菌生长发育及逆境自我保护中的功能分析 

5.1   实验材料 

前人研究表明，Lon 蛋白的缺失，可导致原核和真核生物产生一些非正常生长的现象，如 M.xanthus 不能形成芽孢，S.Cerevisiae 出现呼吸缺陷性细胞且不能在非发酵碳源培养基下生长；在哺乳动物及人细胞中，线粒体 lon 活力的丧失可导致细胞的凋亡；M. oryzae 中 lon 基因-MAP1 的缺失使菌株对 H2O2敏感且致病力降低；在 H. polymorpha 中，当敲除过氧化物酶体的 HpPln 后，酵母细胞的活力下降；在 A.thaliana 细胞内，过氧化物酶体的 lon2 敲除突变株出现过氧化物酶体功能缺陷，进而使生长受阻，而关于 lon 基因在嗜热真菌中的功能至今未曾见有报道，因此，在前一章获得疏绵状嗜热丝孢菌 Mlon 和 Plon 基因敲除及互补/亚细胞定位菌株的基础上，我们以这些菌株为材料进一步研究疏绵状嗜热丝孢菌中 Mlon 和 Plon 基因的功能。 

5.2   研究方法

将 9W-WT、△Mlon、△Plon、ΔMlon/Mlon、ΔPlon/Plon 菌株在 PDA 及 CM培养基上分别活化后转接至新的PDA及CM培养基上，然后置于不同温度（55℃、50  ℃、37  ℃、28  ℃）的培养箱中培养 4 天，4 天后，观察并记录菌落生长状况。每个处理每次做 3 个重复，此实验做 3 次重复。1、将 9W-WT、△Mlon、△Plon、Mlon/Mlon、ΔPlon/Plon 菌株在 PDA 及CM 培养基上分别活化后转接至新的 PDA 及 CM 培养基上于 50 ℃培养箱中培养直到有大量分生孢子产生。 2、收集上述菌株的分生孢子，并将各菌株的分生孢子浓度调至终浓度为1×106个/ml。 3、分别吸取 100 μL 上述各菌株的孢悬液于 150 ml PD 及 CM 液体培养基上，于 50 ℃，150 rpm 摇培 4 天。 4、4 天后，收集各培养瓶中的菌丝体，在吸水纸上吸干后，将其分别平铺到培养皿上，置于 55 ℃烘干箱中烘干。 5、将烘干后的菌丝于电子天平上称重。每个菌株每次做 3 个重复，此实验做 3 次重复。
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第 6 章 全文研究结论

1、以实验室保存的吉粳 88 稻瘟菌野生型菌株为研究材料，以稻瘟菌中一个与 lon 同源的基因-Map1 为出发点，通过稻瘟菌基因组数据库网站在稻瘟菌数据库中进行氨基酸序列比对，发现了另一个依赖 ATP 的 lon 蛋白酶（Magnaporthe grisea_07123），本文将其命名为 MAP2，经过构建该基因的敲除载体，对该基因进行敲除及进一步研究，发现敲除菌株比野生型吉粳 88 生长快，但产孢量、附着胞形态、H2O2敏感性、渗透压胁迫、细胞壁完整性及致病性方面与野生型菌株无差异。 2、以本实验室分离获得的疏绵状嗜热丝孢菌 9W 为材料，以稻瘟菌中一个与 lon 同源的基因-Map1 为出发点，通过与疏绵状嗜热丝孢菌基因组进行氨基酸序列比对，在疏绵状嗜热丝 孢菌基因组中 获得了两个 lon 同源基-Thela2p4_005149 和 Thela2p4_006664，且分别与 Map1 氨基酸序列的相似性为64.61%、24.96%，三者之间的相似性为 50.43%，经亚细胞定位预测分析，hela2p4_005149 和 Thela2p4_006664 分别定位于线粒体和过氧化物酶体，分别将其命名为 Mlon 和 Plon。

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参考文献（略）

本文编号：133396