微波对酪蛋白的糖基化反应及产物功能性质的研究
1 前言
酪蛋白在食品加工中受到越来越多的关注，主要是因为它是全价蛋白质，而且还具有很好的能够赋予食品优良的质构、稳定性和加工特性的功能性质，比如：凝胶性、乳化性和起泡性等。酪蛋白的凝胶性和乳化性是模拟干酪工艺成功的关键，对干酪的质地和流变学性质有很大的影响。但是随着食品加工业的发展和人们生活水平的提高，人们对食品的要求越来越高，酪蛋白的功能性质已经不能完全满足现代食品加工业的需要。所以利用物理、化学和酶的方法进一步改善酪蛋白的功能性质成为很多学者研究的热点。但是在这些改进方法中，例如物理方法对蛋白改性效果不显著，化学方法因为经常使用化学有毒试剂，从而使改性的蛋白存在安全隐患，在食品工业中不能被大量应用。
糖基化反应成为现在研究的焦点，但是糖基化反应也有不完美的地方，所以研究者们利用生物酶催化糖基化反应，对蛋白进行改性，这方面的研究已经有了很大的进展，因为酶促反应具有反应速度比较快，反应需要的条件比较温和，专业性强的优点，但是其缺点就是选择合适的酶及如何控制反应条件比较困难，且酶价格相对比较昂贵，最重要的一点就是反应产物的安全性具有争议。非酶催化糖基化反应就是利用物理方法例如微波加热、微波波和动态高压微射流等催化糖基化反应，这种非酶催化反应容易操作、反应所需要的技术不高，用这样的方法改性的蛋白质没有安全隐患，可以放心的应用在食品加工业中。
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1.2.1 酪蛋白的化学组成与结构
1.2.1.1 酪蛋白的化学组成
乳中特有的一种重要的蛋白质就是酪蛋白(casein)简称 CN。酪蛋白是从脱脂乳中沉淀所得的一大类蛋白质的总称，沉淀的条件是：温度 20℃、等电点 pH 4.6[1]。酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白质之一。乳是乳白色的液体，有哺乳动物乳腺分泌的产物，具有很丰富的营养。牛乳中的营养成分主要包括蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等，这些营养成分的含量比例和人类对营养的需要很吻合，生物利用率比较高，另外乳中还存在对人和动物生长、免疫有特殊功能的蛋白质，所以牛乳可以作为新生儿的全价哺饲的营养物质。αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和 κ-酪蛋白是组成酪蛋白的成分，这些成分的总和占到牛乳中总蛋白的 76%-86%。另外还有 β-酪蛋白水解产物：γ-酪蛋白和肽，糖基化的 κ-酪蛋白、磷酸化的 αs1 和 αs2-酪蛋白等。这些成分都是有原来的成分通过糖基化、磷酸化和水解衍生而来[2-4]。其性质和组成分别见表 1-1 和表 1-2。
1.2.1.2 酪蛋白的结构
酪蛋白属于球蛋白，，所以的氨基酸经过折叠和螺旋形成比较典型的球蛋白的模式。酪蛋白的疏水性比较强，难溶于水，比大多数球蛋白的平均值要稍高一些。酪蛋白的氨基酸基团比较活跃，一般在苏氨酸残基、丝氨酸残基上发生不同程度的磷酸化，这些变化都属于化学改性[5, 6]。另外，κ-酪蛋白比较活跃，可以发生糖苷化反应。在酪蛋白的氨基酸结构中，κ-、αs2-半胱氨酸、胱氨酸残基在二硫键和游离巯基的含量变化中发挥很大作用[7]。 酪蛋白在牛乳中的存在状态是胶束形式。酪蛋白胶束有复杂的胶粒组成，这些粒子的大小平均在 0.4μm左右。这些胶粒是特殊的分子聚合物，聚合物含有数百甚至上千的单个分子，这些分子还包括结合的磷酸钙、数量不多的钾、钠、镁，以及柠檬酸盐。酪蛋白之所以能形成这么复杂的结合体，是因为疏水基、亲水基，以及电离化基团，在酪蛋白中大量的存在。
目前，牛乳酪蛋白的一级结构已经测定。 1971 年测定了 αs1-酪蛋白的一级结构，含有氨基酸的个数为 199 个，牛奶中总蛋白含量的 39-46%为 αs1-酪蛋白[8]。αs1-酪蛋白属于钙敏性蛋白质，这样的蛋白质的特征结构是含有可以磷酸化的基团。αs1-酪蛋白中存在 8 个磷酸基，总分子量 23600。αs1-酪蛋白虽然半胱氨酸含量不多，但是脯氨酸含量比较多。αs1-酪蛋白另外一个特点就是一些氨基酸残基的分布不均匀，尤其是疏水性的、带电荷的残基分布，αs1-酪蛋白是一个很独特的偶极结构，这个结构含有一个具有高度溶剂化的带电部分，还含有一个具有疏水性的球状部分。αs2-酪蛋白有 207 个氨基酸组成，分子中还含有磷酸基 10-13个，巯基 2 个，占牛奶总蛋白 8%-11%。仅有两个区域相对疏水，即 C 端序列的 160-207 位和 90-120 位，因而 αs2-酪蛋白在酪蛋白中具有最强的亲水能力。奶中总蛋白量 25%以上是β-CN， 它占酪蛋白的 22%以上。β-CN 含有的氨基酸残基数是 209 个，它结构的 N 端和 C端具有清晰的区分，N-末端含有带有负电荷的磷酸丝氨酰基(1-60)，呈酸性和亲水性， C-末端是酪蛋白疏水性最强的部位，氨基酸的序列为 141-209，这部分呈碱性和疏水性[9]。因而 4种酪蛋白中最疏水的是 β-酪蛋白。此外 β-酪蛋白可以影响酪蛋白的结构，因为它的结构中有大量的脯氨酸残基存在，这些残基可以影响 α-螺旋、β-折叠的结构形成。
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2 材料与方法
2.1.1 材料与试剂
主要试验材料及试剂见表 2-1 所示：
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2.2.1 微波加热对酪蛋白糖基化反应进程的影响
2.2.1.1 不同功率对酪蛋白糖基化反应的影响
酪蛋白浓度为 6%，溶解在磷酸缓冲液里(0.667 mol/L，pH7.8)，酪蛋白与葡萄糖的比例为 1：1（w/w），反应溶液的量为 300mL，控制温度 90℃，微波加热 20min，选择微波功率100W，300W，500W，700W，900W，检测接枝度和褐变，研究不同功率微波加热对酪蛋白糖基化反应程度的影响。
2.2.1.2 不同加热时间对酪蛋白糖基化反应进程的影响
酪蛋白溶解在 0.667 mol/L 磷酸缓冲液里(pH7.8)，浓度为 6%，蛋白与葡萄糖的比例为 1：1（w/w），反应溶液的量为 300mL，控制温度 90℃，微波功率 500W，选择微波加热 5 min, 15min，20min，25 min，30 min，检测接枝度和褐变，研究不同微波加热时间对酪蛋白糖基化反应程度的影响。
2.2.1.3 不同的还原糖对酪蛋白糖基化进程的影响
酪蛋白溶解在磷酸缓冲液里(0.667 mol/L，pH7.8)，浓度为 6%，蛋白与还原糖的比例为 1：1（w/w），反应溶液的量为 300mL，控制温度 90℃，微波功率 500W，加热时间 20min，选择葡萄糖、乳糖、低聚异麦芽糖、β 环糊精，检测接枝度和褐变，研究微波加热条件下不同还原糖对酪蛋白糖基化反应程度的影响。
2.2.2 微波加热与水浴加热对酪蛋白糖基化反应的对比研究
2.2.2.1 微波加热对酪蛋白结构的影响
酪蛋白溶解在磷酸缓冲液里(0.667 mol/L，pH7.8)，浓度为 6%，反应溶液的量为 300mL，控制温度 90℃，微波功率 500W。与水浴加热作比较，研究微波加热对酪蛋白结构的影响。表 2-3 所表示的是各样品的处理方式。处理以后紫外全波长扫描和荧光光谱分析酪蛋白结构的变化，并分析结果。
2.2.2.2 不同加热时间下微波与水浴加热酪蛋白糖基化反应的影响
酪蛋白溶解在 0.667 mol/L 磷酸缓冲液里(pH7.8)，浓度为 6%，蛋白与葡萄糖、β 环糊精的比例（1：2, 1:3 w/w），反应溶液的量为 300mL，控制温度 90℃，试验用的微波功率 500W，与水浴加热（90℃）做对比，选择不同的加热时间 10min，20min，30min，40min，50min，60min。紫外分光光度计检测糖基化中间产物、游离氨基含量、褐变程度、二硫键、巯基的变化，并检测了两种加热方式对糖基化后酪蛋白的分子量变化，分析结果，系统阐述微波加热对酪蛋白糖基化反应的影响。
2.2.3 微波加热对酪蛋白糖基化产物功能性质的影响
酪蛋白溶解在 0.667 mol/L 磷酸缓冲液里(pH7.8)，浓度为 6%，蛋白与 β 环糊精的比例（1：1w/w），反应溶液的量为 300mL，控制温度 90℃，微波功率 100W、300W、500W 和 700W，加热 10 min、20min、30 min，与水浴加热（90℃,60min）和未处理酪蛋白双对照，利用流变仪、质构仪、紫外分光光度计等检测糖基化产物的凝胶性、乳化性、起泡性、抗氧化性的变化，系统阐述微波加热对酪蛋白糖基化产物的影响。
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3.1 微波加热对酪蛋白糖基化反应进程的影响 .........................................31
3.1.1 酪蛋白成分分析 .............................................................31
3.1.2 微波的功率对糖基化反应的影响 ...............................................31
3.1.3 微波加热时间对糖基化反应的影响..............................................32
4 讨论............................................................................67
4.1 微波加热蛋白质糖基化的优势 ..................................................67
4.2 微波加热与水浴加热对酪蛋白糖基化的影响 .......................................69
4.3 微波加热对酪蛋白功能性质的变化 ..............................................70
4.4 微波加热对酪蛋白结构变化....................................................73
5 结论...........................................................................76
4 讨论
（1）蛋白质糖基化改性的必要性
蛋白质和糖类是组成食品体系的重要成分，在食品体系中处于共存状态，二者之间的相互作用是影响食品体系流变学特性、稳定性和口感的主要因素[184]。蛋白质和糖易发生接枝反应，且研究发现，蛋白质与还原糖发生糖基化反应可以提高蛋白质的功能特性[185]。酪蛋白是一种重要的蛋白产品，已经广泛应用于食品及其他行业中，其蛋白质含量高达 90%以上[186]。但是没有完美的食物，酪蛋白也不完美，它的乳化性、凝胶性等性质，不如某些植物源蛋白质的功能性质，而且它较差的溶解性也使它减分不少，限制其在食品工业中的广泛应用，因此需要对酪蛋白进行改性处理来获得优良功能特性[187]。
酪蛋白是一种全价蛋白质，因为其氨基酸比例比较合理。酪蛋白可以作为很多食品的重要成分，是人们的关注的焦点。不可否认的是，酪蛋白也有自己的缺陷。例如：酪蛋白在等电点（pH 4.6）左右的时候，甚至 ph 值更小的时候，它的溶解度、乳化性都很不理想。在食品加工的过程中，酪蛋白就不能被应用于酸性体系的食品中。这也是我们对酪蛋白改性的目的和意义所在，也是酪蛋白改性的必要性所在。酪蛋白改性除了自身的缺点更得改善，另外一个好处就是蛋白质-糖改性后，可以作为优良的多功能添加剂在食品中应用。反应产物中含有蛋白质、糖两种天然生物分子，反应的条件中不需要任何化学催化剂参与，这个反应正符合了现代社会与日俱增的对天然添加剂的需求，因而反应产物会得到人们的肯定。 本论文研究了酪蛋白与还原糖的美拉德反应，检测了接枝反应的程度，一定程度的提高了酪蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性、抗氧化性等功能性质，功能性质的改善会使酪蛋白在食品或医药等领域中的应用的更为广泛，反应产物可以作为新型功能性食品配料、添加剂，这样的研究是一种新的尝试。
（2）传统加热糖基化的优点与不足
社会的发展，提高了人们的生活水平，人们对食品的要求越来越高，蛋白质在食品的发展中的作用越来越重要。食品方向的研究人员经过很长时间的努力，主要致力于改善蛋白质的功能特性，利用的改性方法是：物理方法、酰化、磷酸化、糖基化及去酰胺等化学方法，以及生物酶工程的方法。总结以上所有的方法，各有优缺点，例如化学方法因为会涉及一些有毒试剂，从而导致改性后的蛋白很难在食品行业应用，物理方法改性的效果不明显。经过以上分析，从 90 年代的初期开始，蛋白质改性的科研重点转移到了蛋白质与糖的糖基化反应。蛋白质与糖只要加热就可以自发地发生糖基化反应，反应的过程中没有任何作为催化剂化学试剂添加。因此，我们可以通过反应条件的把控，来获得我们所需要的糖基化产物，这将会成为蛋白改性的一个好的方法。
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5 结论
1. 本论文研究表明，褐变程度和接枝度随着微波功率和微波时间的增大逐渐增加，但是微波功率增加到 500W 以后接枝度的增加速率减少，微波时间 20min 以后接枝度的增加速率减少，综合褐变程度来考虑，后续试验选择的功率为 500W，微波时间 20min。微波加热时酪蛋白与还原糖的接枝反应的顺序为 β 环糊精>葡萄糖>乳糖>低聚异麦芽糖。
2 ．内源荧光光谱和紫外光谱分析表明，微波加热处理后酪蛋白在 220-238 nm 和260-340nm 的紫外吸收值高于水浴加热的酪蛋白、未处理的酪蛋白，內源荧光吸收峰值发生红移现象。微波加热可以稳定的促进酪蛋白与葡萄糖糖基化的进行，这样的现象对于 β 环糊精来说并没有发生，水浴加热和微波加热对于中间产物的影响不显著。微波加热对于酪蛋白与葡萄糖、β 环糊精的褐变程度（A420）显著高于水浴加热的样品。微波加热和水浴加热对酪蛋白二硫键的含量变化不显著，但是对于酪蛋白与葡萄糖、β 环糊精的糖基化反应后，二硫键的含量变化差异显著。微波加热 30 分钟后的糖基化酪蛋白与水浴加热 60 分钟电泳条带相似，间接说明微波加热糖基化反应可以缩短时间，节约成本。
3．微波加热对酪蛋白功能特性的影响：微波加热处理对反应产物功能性质的改善程度不尽相同。试验结果表明：当微波时间为 20min，微波功率为 500W 时，微波加热糖基化产物凝胶强度为 134g，是水浴加热的 1.19 倍。酪蛋白、水浴加热糖基化酪蛋白和微波加热（500W，20min）糖基化酪蛋白的持水性依次增加，分别为 5.08,13.13 和 17.1g.g-1蛋白质。酪蛋白、水浴加热糖基化酪蛋白和微波加热糖基化酪蛋白的吸油性下降。凝胶微观结构分析：经过糖基化处理后，酪蛋白-β 环糊精的接枝产物凝胶网状空隙较小且孔径大小均匀，微波加热处理，凝胶网络结构逐渐变得规则、致密。微波加热处理的酪蛋白糖基化产物的表观黏度最高，不仅高于水浴加热处理的酪蛋白糖基化产物的，而且显著高于未处理酪蛋白分散液的表观粘度。在 0-6 个月的贮藏期间，酪蛋白与糖基化酪蛋白的凝胶硬度都下降，但变化不明显。微波处理可以显著提高接枝物的起泡性和起泡稳定性。当微波加热（500W，20min）和水浴加热酪蛋白糖基化时，美拉德反应产物的还原能力分别为 0.59 和 0.57，显著高于未经过糖基化处理的酪蛋白还原能力(P < 0.05)。当微波处理 20min 时，随着微波功率的增大，美拉德产物对脂质体过氧化的抑制率逐渐增加，当微波功率增加到 500W 时，由酪蛋白制得的美拉德反应产物对脂质体过氧化的抑制率可达 73.1%，显著高于未经加热处理的样品（63.42%）(P < 0.05)，水浴加热后的酪蛋白美拉德产物对脂质体过氧化的抑制率为 67.13%，比未处理的样品增加，但是没有达到差异显著的水平(P ＞ 0.05)。在微波功率增加到 500W 时，酪蛋白与 β 环糊精的产物对羟基自由基清除率从 6.97%提高到 14.937%，显著高于未处理酪蛋白的自由基清除率（5.53%）(P < 0.05)，水浴加热后美拉德反应产物的对羟基自由基清除率为 9.6%，比未处理酪蛋白的自由基清除率提高了 4.07%。微波处理对酪蛋白-β 环糊精产物的 EAI 和 ESI 都有显著改善，这不仅与酪蛋白改性有关，可能还与微波辐射对酪蛋白结构的影响有关。
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参考文献（略）
本文编号：45219
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/xindetihui/45219.html
