柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

发布时间：2024-05-19 06:06

　　【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer~?RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA...

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【部分图文】：

图1CVEV5′末端RACE及克隆

依据5′及3′端保守序列设计直接扩增CVEV基因组全长的引物EV25-F/EV5983-R。以2.1提取的总RNA为模板，进行CVEV的基因组全长RT-PCR。琼脂糖凝胶电泳结果显示（图2),PCR产物片段大小约5983bp，符合预期CVEV基因组全长大小，切胶回收备用。2.....

图2CVEV的基因组全长RT-PCR

使用限制性内切酶SmaI和StuI酶切pXT1双元表达载体。将2.2获得的RT-PCR产物和pXT1线性载体切胶回收、In-FusionHDCloningKit连接、转化大肠杆菌JM109。挑取单菌落采用引物VE16-F/VE17-R进行菌液PCR筛选，然后采用引....

图3CVEV全长cDNA克隆的PCR鉴定

图2CVEV的基因组全长RT-PCR随机选取6个阳性克隆，命名为CVEV1901—CVEV1906并进行序列测定。结果表明所获克隆均符合CVEV基因组全长预期，序列之间的一致性为99.35%。其中，CVEV1901全长5983nt，由5个ORF、5′端207nt和3′端1....

图4CVEV与黄矮病毒科中其他病毒全长基因序列的系统进化树

将获得的CVEV全长cDNA克隆CVEV1901和CVEV1902分别转化农杆菌GV3101，以pTX1空载体为阴性对照，真空浸润接种尤力克柠檬实生苗。接种30d后，抽提系统新发叶片RNA进行RT-PCR检测，结果表明两株CVEV1901接种的尤力克植株检测出CVEV特异性条带....

本文编号：3977705