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本站编辑：admin 日期： 2010-08-17 21:15 点击：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】目的筛选乙型肝炎病毒启动子的转录调控因子并对其中之一的apoA-Ⅰ因子与乙肝病毒各启动子的相互作用进行深入研究。方法首先采用等离子共振技术对乙型肝炎病毒启动子结合蛋白进行筛选:将结合有亲和素的HBV各启动子耦联在SA芯片上,使核酸序列游离于芯片之上,与流动相的HepG2.2.15细胞核蛋白充分接触,洗脱并回收与启动子结合的蛋白。该结合蛋白混合品经short-gun质谱分析,显示在乙型肝炎病毒核心启动子、S1、S2启动子的结合蛋白中,均有载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)。随后构建含有apoA-Ⅰ基因的重组质粒pcDNA3.1-apoA-Ⅰ及含有HBVS1、S2、X启动子的重组质粒pCAT3-S1、pCAT3-S2、pCAT3-X。用脂质体法共转染HepG2细胞,以pcDNA3.1及pCAT3-basic为对照。细胞转染48h后提取细胞蛋白,用检测CAT的ELISA试剂盒检测各组蛋白中报告基因CAT含量。然后再采用等离子共振技术对apoA-Ⅰ与各启动子的结合进行验证及动力学分析:将apoA-Ⅰ蛋白耦联在CM5芯片上作为固定相,以各启动子核酸片段为流动相,获得该蛋白与各启动子核酸的结合动力学参数,并利用激光共聚焦显微镜和western blotting对该蛋白在HepG2和HepG2.2.15细胞中的亚细胞定位及表达水平进行进一步的研究。结果Real-time PCR结果显示,乙肝病毒复制细胞模型HepG2.2.15细胞中apoA-ⅠmRNA表达显著高于无乙肝病毒复制的细胞系HepG2。激光共聚焦结果显示HepG2.2.15细胞核中可检测到apoA-Ⅰ蛋白的表达,而HepG2细胞核中则无。ApoA-Ⅰ可顺式调控乙肝病毒核心启动子及X启动子的转录活性。ApoA-Ⅰ与乙肝病毒各启动子均有结合,其中与S2启动子的结合常数最高(7.98×10~5),与S1启动子的平衡解离常数最高7.66×10~(-4)。
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