SREBP-2诱导肝细胞成脂的研究

发布时间：2017-10-10 02:34

  本文关键词：SREBP-2诱导肝细胞成脂的研究

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【摘要】：肝脏是人们体内以代谢功能为主的重要的生命器官,在体内发挥着去毒素、糖原储存以及分泌、蛋白质合成等重要作用,当细胞内脂类物质代谢紊乱就会产生诸多疾病(如非酒精性脂肪肝等)。肝脂代谢是一个复杂的多因子参与共同调控的在机体内动态平衡的过程,SREBPs家族为现阶段公认的调节脂类物质代谢的关键转录因子,在脂肪酸、胆固醇等脂类物质代谢过程中发挥重要作用,SREBP-2是该家族成员之一,在脂类物质代谢过程中发挥重要调节作用,然而具体调节机制还不甚明了。为深入研究SREBP-2调节肝脂代谢过程与分子机制,本文首先以成年小鼠为肝细胞供体,用酶消化法分离获得肝原代细胞,并进行原代与传代培养;然后对分离的肝细胞用形态观察法与过碘酸-雪夫法初步鉴定,确定分离的原代细胞为肝细胞。最后用介导SREBP-2过表达的腺病毒侵染肝细胞,用实时荧光定量PCR方法检测肝细胞中SREBP-2,C/EBPα,FAS和SREBP-1c四个基因的相对表达量,分析SREBP-2调节肝脂代谢的分子机制。得到如下结果:(1)应用“酶消化法”成功分离得到了高产量与高成活率的原代肝细胞,过碘酸-雪夫反应鉴定发现细胞被染成红色,并且形态均一,说明细胞内含有大量的肝糖原,进一步说明分离的肝细胞纯度较高;(2)荧光定量结果显示Ad-SREBP-2腺病毒能够介导SREBP-2基因在原代肝细胞中过表达,且表达量提高80倍以上;(3)油红O染色观察显示SREBP-2过表达后能够促进肝细胞脂滴的合成与沉积;(4)SREBP-2过表达对脂肪酸合成酶(FAS)与固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的表达具有显著的促进作用,而对转录因子CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)基因的表达没有显著影响。综上,本研究分离得到了大量的原代肝细胞并进行了鉴定,并且SREBP-2过表达后能够显著促进胞内脂类沉积与脂类合成相关基因的高表达,说明SREBP-2在肝细胞脂质合成过程中发挥重要的调节作用,可能是肝脂代谢紊乱的关键调节因子。
【关键词】：I肝细胞 肝细胞的培养 实时定量 固醇调节元件结合蛋白2
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R33
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 文献综述11-24
• 1.1 肝细胞的分离11-13
• 1.1.1 非酶消化法12
• 1.1.2 酶消化法12-13
• 1.2 肝细胞的培养13-16
• 1.2.1 肝细胞的原代培养及方法13-15
• 1.2.2 肝细胞的传代培养15-16
• 1.3 肝细胞的鉴定16-17
• 1.4 SREBPs基因的研究17-21
• 1.4.1 SREBPs简介17-18
• 1.4.2 SREBPs前体裂解18-19
• 1.4.3 SREBPs的转录调控19-21
• 1.5 脂肪代谢相关转录因子与限速酶基因介绍21-22
• 1.5.1 C/EBPα核转录因子21-22
• 1.5.2 FAS22
• 1.6 研究的目的和意义22-23
• 1.7 研究内容23-24
• 第二章 肝细胞的分离、培养、鉴定及SREBP-2 诱导成脂的研究24-34
• 2.1 材料与方法25-26
• 2.1.1 动物肝脏组织25
• 2.1.2 主要试剂25
• 2.1.3 主要耗材25
• 2.1.4 主要仪器设备25-26
• 2.1.5 试验试剂的配制26
• 2.2 实时定量PCR引物的设计与合成26
• 2.3 肝细胞分离培养与鉴定26-29
• 2.3.1 肝细胞分离26-27
• 2.3.2 肝细胞原代培养27
• 2.3.3 传代培养27-28
• 2.3.4 过碘酸-雪夫反应鉴定肝细胞28-29
• 2.4 介导小鼠SREBP-2 过表达腺病毒的扩繁29
• 2.5 病毒滴度测定29
• 2.6 最佳感染复数的测定29-30
• 2.7 肝细胞传代培养与病毒侵染30
• 2.8 总RNA提取与反转录30-31
• 2.9 油红-O染色观察31-32
• 2.10 SREBP-2 等基因的定量分析32-34
• 第三章 实验结果与分析34-46
• 3.1 实时荧光定量PCR引物设计34
• 3.2 肝细胞分离培养与鉴定34-39
• 3.2.1 肝细胞的原代培养34-37
• 3.2.2 肝细胞的传代培养37-38
• 3.2.3 过碘酸 -雪夫反应（PAS）鉴定肝细胞38-39
• 3.3 病毒滴度测定与MOI值测定39
• 3.4 Ad-SREBP-2 与Ad-CMV病毒侵染细胞39-40
• 3.5 侵染病毒的肝细胞油红-O染色40-42
• 3.6 总RNA的提取与基因定量42-46
• 3.6.1 肝细胞总RNA的提取与反转录42
• 3.6.2 SREBP2基因过表达检测42-43
• 3.6.3 脂代谢相关基因表达检测43-46
• 第四章 结果讨论与结论46-54
• 4.1 肝细胞的分离纯化46-47
• 4.2 肝细胞的培养47
• 4.3 肝细胞的鉴定47-48
• 4.4 Ad-SREBP-2 腺病毒侵染肝细胞48-50
• 4.4.1 介导外源基因转染肝细胞48-49
• 4.4.2 Ad Easy腺病毒载体系统49
• 4.4.3 病毒滴度和MOI值测定49-50
• 4.4.4 Ad-SREBP-2 病毒侵染肝细胞50
• 4.5 总RNA的提取50
• 4.6 SREBP-2 基因对肝细胞脂滴沉积的影响50-51
• 4.7 SREBP-2 对FAS、C/EBPα和SREBP-1c的调控作用51-53
• 4.7.1 SREBP-2 与SREBP-1c家族内相互调控作用51
• 4.7.2 SREBP-2 调节FAS转录表达51-52
• 4.7.3 SREBP-2 调节C/EBPα转录表达52-53
• 4.8 结果与结论53-54
• 附录54-55
• 参考文献55-61
• 致谢61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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中国博士学位论文全文数据库 前2条

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2 王虹;牛CCAAT增强子结合蛋白家族（C/EBPs）诱导细胞转分化的研究[D];西北农林科技大学;2013年

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本文编号：1003883