染料木黄酮抑制人巨细胞病毒即刻早期蛋白表达的实验研究

发布时间：2017-10-28 04:32

  本文关键词：染料木黄酮抑制人巨细胞病毒即刻早期蛋白表达的实验研究

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【摘要】：目的:1.探究人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirous,HCMV)感染人星形胶质细胞(Astrocytes,AS)即刻早期蛋白IE72表达变化。2.通过检测染料木黄酮(Genistein,Gen)抑制HCMV感染AS引起的即刻早期蛋白IE72及其m RNA的表达变化,以此探讨Gen对HCMV感染AS的影响。再检测IE72基因启动子区域(major immediate early promoter,MIEP)组蛋白乙酰化水平,进一步探讨Genistein抑制人星形胶质细胞HCMV感染的分子生物学机制。方法:1.纯化新取材的原代AS,免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)标记星形胶质细胞的标志性蛋白——胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。2.MTT检测实验组和对照组细胞活性。3.分别用Real-time PCR和Western blot检测IE72m RNA和蛋白的表达情况,实验分为HCMV组、Gen组、用含40μM Gen的2%DMEM/F12培养液预处理细胞4h后,以MIO=5的HCMV感染AS组(Gen+HCMV组)、细胞培养至基本融合后更换含2%FBS的D/F12维持培养,以MIO=5的HCMV感染AS,置恒温培养箱中孵育4 h后弃去培养液,更换含40μM Gen的2%DMEM/F12培养液组(HCMV+Gen组)和对照组。4.染色质免疫共沉淀法(Ch IP)检测HCMV组、Gen+HCMV组、HCMV+Gen组和对照组的主要即刻早期基因启动子区域(MIEP)组蛋白H3乙酰化水平。结果:1.Cy3标记的抗GFAP显示95%以上细胞为AS。2.MTT显示:40μM Gen+HCMV组24 h、48 h、72 h的吸光值显著高于HCMV组(P0.05);病毒形态感染48h后,HCMV组细胞有明显的细胞病变效应(CPE),40μMGen+HCMV组细胞状态良好。3.RT-q PCR结果显示:感染24h、48h、72 h和96h时HCMV+Gen组及Gen+HCMV组IE72的m RNA表达明显低于HCMV组(P0.05)。4.Western blot结果显示:感染HCMV+Gen组及Gen+HCMV组细胞的IE72蛋白表达都明显低于HCMV组(P0.05)。5.Ch IP法提取MIEP组蛋白H3乙酰化的结果显示:Gen+HCMV组和HCMV+Gen组的水平明显低于HCMV组。结论:1.HCMV能够感染原代星形胶质细胞,是其容许细胞。2.适当浓度的Gen能抑制HCMV感染AS后IE72基因和蛋白表达。3.Gen抑制HCMV IE72基因和蛋白表达可能是通过Gen抑制MIEP组蛋白H3乙酰化来实现的。
【关键词】：染料木黄酮 人巨细胞病毒 即刻早期蛋白 组蛋白乙酰化
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-7
• 引言7-8
• 第一章 实验材料8-12
• 1.1 材料8-10
• 1.1.1 细胞8
• 1.1.2 病毒8
• 1.1.3 实验药物8
• 1.1.4 试剂8-9
• 1.1.5 仪器设备9-10
• 1.2 主要试剂配制10-12
• 第二章 实验方法12-20
• 2.1 细胞培养12-13
• 2.2 HCMV AD169株毒种的制备和定量13-14
• 2.3 MTT比色法检测染料木黄酮对AS细胞增殖作用的影响14
• 2.4 RT-qPCR检测HCMVIE72 mRNA水平表达的变化14-16
• 2.5 蛋白提取与Western blot16-17
• 2.6 ChIP实验检测IE启动子区域（MIEP）组蛋白乙酰化水平17-20
• 第三章 结果20-28
• 3.1 人原代星形胶质细胞的取材、纯化及鉴定20
• 3.2 人胚肺成纤维细胞的培养20-21
• 3.3 HCMV AD169毒株的扩增和定量21
• 3.4 各组细胞感染HCMV 24和 48h的形态学观察21-23
• 3.5 MTT比色法检测染料木黄酮对AS细胞增殖作用的影响23-24
• 3.6 HCMV组、HCMV+Gen组和Gen+HCMV组细胞感染HCMV IE mRNA水平的相对表达量24-25
• 3.7 各组细胞感染HCMV 1、2、3 和 4 d时Western blot检测IE蛋白水平的变化25-26
• 3.8 ChIP法MIEP乙酰化检测结果26-28
• 第四章 讨论28-31
• 参考文献31-34
• 综述 染料木黄酮与HCMV感染34-45
• 参考文献42-45
• 致谢45-46

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本文编号：1106714