IGFBP2基因敲除导致的CRF和IGF组织特异性表达

发布时间：2017-10-30 22:10

  本文关键词：IGFBP2基因敲除导致的CRF和IGF组织特异性表达

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【摘要】：背景和目的促肾上腺激素皮质释放激素(Corticotropin releasing factor, CRF)是由下丘脑PVN区神经元合成并分泌的一种应激神经肽,其受体包括CRFR1和CRFR2受体。它们在下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)的功能中起重要作用。类胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)家族包括两种配体(IGF-1和IGF-2),相应的受体(IGF-1R和IGF-2R)及六种结合蛋白(IGFBP1～6)。IGF家族在调节细胞增殖、存活、分化和迁移等方面具有重要的生物学功能。我们实验室主要研究低氧神经内分泌网络调节机制,CRF及其受体起核心作用,低氧影响肝脏和脑组织的IGF家族表达,本实验通过整体动物和细胞学实验,研究低氧下CRF家族和IGFBP家族可能的调节机制,以及低氧对相关细胞因子的影响；利用敲除IGFBP2小鼠比较CRF家族和IGF家族的组织表达特异性；在AtT-20细胞系上研究了转录因子AP-1和NF-κB对CRFR1和IGF-1R受体转录的调节。整体水平上,本实验利用低压低氧舱模拟7 km低氧环境,研究大鼠暴露于急性低氧(1、4、8和24 h)和拮抗剂(PDTC, NF-κB拮抗剂和CP154,526, CRFR1拮抗剂)处理后,皮层和垂体CRF, CRFR1和IGF家族基因表达变化,并利用IGFBP2敲除的小鼠和正常野生型C57小鼠比较研究CRF家族和IGF家族在皮层和海马区的基因表达变化。细胞水平上,利用AtT-20细胞系,给予CRF孵育,研究转录因子AP-1和NF-κB对CRFR1和IGF-1R的转录调节。实验设计和方法整体实验：1.大鼠实验：大鼠暴露于低氧舱模拟的低氧(7 km,1、4、8和24 h),动物分组为：对照组,不同时间的低氧暴露组,拮抗剂组,低氧后收集垂体,皮层和血液白细胞。2.小鼠实验：不同发育年龄的C57小鼠和IGFBP2 knock-out小鼠,在出生15d和45d分别收集海马和皮层。细胞实验：利用小鼠垂体瘤细胞系(AtT-20),分为对照组,CRF处理组(10 nM),拮抗剂组(AP-1或NF-κB inhibitor),拮抗剂+CRF组等。研究CRF通过转录因子AP-1和NF-κB调节CRFR1和IGF-1R转录。研究采用实时定量PCR和Western-Blot进行检测。实验结果1.急性低氧呈低氧时间(7 km,1,4和8h)相关地增加大鼠垂体CRF mRNA的表达,24 h时降低但仍高于对照水平；急性低氧1,4,8 h显著降低大鼠垂体CRFR1 mRNA的表达,但24 h时回到对照水平。2.急性低氧7km 8h明显降低了大鼠垂体和皮层IGF-1 mRNA表达；低氧4,8 h增加了垂体和皮层IGF-1R mRNA的表达。3. NF-κB拮抗剂和CRFR1拮抗剂部分阻断了低氧诱导的垂体CRF mRNA表达增加;也阻断了低氧诱导的垂体CRFR1 mRNA表达的下降和垂体IGF-1R mRNA的增加。但是NF-κB拮抗剂不能阻断低氧诱导的垂体IGF-1 mRNA表达的下降;CRFR1拮抗剂可以阻断低氧诱导的垂体IGF-1 mRNA表达的下降。4.急性低氧呈低氧时间相关地(7 km,1,4和8h)增加大鼠皮层和血液白细胞TNF-α, IL-1β和IL-6 mRNA的表达。5. NF-κB拮抗剂阻断了低氧诱导的血液白细胞TNF-α, IL-1β和IL-6 mRNA表达的增加；CRFR1拮抗剂阻断了由低氧诱导的IL-1p和IL-6 mRNA表达的增加,但没有影响TNF-amRNA表达的增加。6.在C57小鼠海马中,随年龄发育,IGFBP2, CRFR1和IGF-1R mRNA表达水平降低,而CRF, SPAR和NR-2B mRNA的表达无明显变化；在IGFBP2K0的小鼠中,与正常小鼠比较,IGFBP2, CRF, CRFR1, IGF-1R, SPAR和NR-2B的mRNA的表达量都显著的下降,但不同发育阶段无明显差异；在C57小鼠皮层中,随年龄发育,IGFBP2, CRF和NR-2B mRNA表达水平降低,而SPAR和IGF-1R mRNA表达上升,CRFR1 mRNA表达水平无明显变化；在IGFBP2K0的小鼠中,与正常小鼠比较,IGFBP2, IGF-1R, SPAR和NR-2B的mRNA的表达量都显著的下降,CRF的mRNA的表达量随年龄发育下降,CRFR1 mRNA表达水平无明显变化。正常小鼠海马组织的IGFBP2蛋白随年龄发育增加。7.在AtT-20细胞系中,常氧下CRF显著降低CRFR1 mRNA表达,升高IGF-1R的mRNA表达,AP-1拮抗剂可以阻断CRF引起的CRFR1基因表达的下降,不影响IGF-1R基因表达;NF-κB拮抗剂不能阻断CRF引起的CRFR1基因表达的下降,也不能阻断CRF引起的IGF-1R基因表达的上升。低氧24h,CRF进一步升高了CRFR1和IGF-1R的mRNA的表达,AP-1拮抗剂不能阻断CRF引起的CRFR1和IGF-1R的基因表达的上升；但NF-κB拮抗剂可以阻断CRF引起的CRFR1和IGF-1R的基因表达的上升。小结急性低氧垂体CRFR1和IGF-1 mRNA表达显著下降,而CRF和IGF-1R mRNA表达显著上升。急性低氧显著增加皮层和血液白细胞TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的表达,CRFR1和NF-κB参与其基因表达的调节。不同发育年龄小鼠CRF和IGF家族具有不同的表达模式,IGFBP2在海马神经元的发育中可能起重要作用。在常氧下,AP-1起负调节作用调控CRFR1基因的转录；在低氧下,NF-κB起正调节作用调控CRFR1基因的转录。
【关键词】：低氧 垂体 皮层 海马 白细胞 类胰岛生长因子 细胞因子 转录 促肾上腺皮质激素释放激素 促肾上腺皮质激素释放激素受体1
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 中英文缩略14-16
• 1 引言16-18
• 2 材料与方法18-29
• 3 实验结果29-41
• 3.1 急性低氧对大鼠垂体和皮层CRFs和IGFs基因表达的影响29-32
• 3.2 急性低氧对大鼠皮层和血液白细胞炎症因子基因表达的影响32-34
• 3.3 IGFBP2KO小鼠CRFs和IGFs基因表达特异性比较34-37
• 3.4 转录因子AP-1和NF-κB参与CRFR1和IGF-1R转录37-41
• 4 讨论与结论41-44
• 结论43
• 主要创新点43-44
• 参考文献44-47
• 综述47-66
• 参考文献59-66
• 作者简历及在读期间取得的科研成果66-67
• 基金资助声明67

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