霍乱弧菌转录调控因子AphBC端结构域的原核表达与纯化结晶

发布时间：2017-11-21 18:01

  本文关键词：霍乱弧菌转录调控因子AphBC端结构域的原核表达与纯化结晶

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【摘要】：目的 AphB是霍乱弧菌毒力基因表达调控网络中重要的转录调控因子,可激活毒力基因表达,本实验目的在于得到AphB蛋白C端结构域的晶体结构,为研究其与辅助诱导物结合之后的构象改变对于毒力调控网络的影响奠定基础。方法以霍乱弧菌的AphB蛋白C端结构域为对象,将目的基因克隆到表达载体pET-32a(+)上,使重组质粒在大肠埃希菌中高效表达目的蛋白,然后利用镍离子亲和层析、MonoQ离子交换层析和GF75凝胶过滤层析法进行纯化。分别选取5、10、20和30mg/ml的目的蛋白,采用悬滴气相扩散法进行蛋白结晶,筛选结晶试剂盒条件,在得到初晶的结晶条件基础上通过改变蛋白与池液混合比例、结晶池液成分、环境温度等进行结晶条件的优化。结果含有目的基因的重组质粒在大肠埃希菌中高效表达可溶性目的蛋白。利用3种蛋白纯化方法依次进行纯化,得到较高纯度的目的蛋白。对蛋白结晶试剂盒结晶条件进行优化,得到的最优结晶条件为:蛋白浓度为30mg/ml;池液成分为0.1mol/L BIS-TRIS,2.0mol/L Ammonium sulfate,pH 5.0,18℃环境孵育24h。用优化的结晶条件进行结晶处理,得到分辨率为2.1姒的蛋白晶体。结论通过原核表达和用优化的结晶条件得到了霍乱弧菌AphB蛋白C端结构域的蛋白晶体,所得数据为蛋白的空间结构解析提供了重要依据,对蛋白C端结构域与辅助诱导物结合的功能研究奠定了基础。
【作者单位】： 承德医学院;南京农业大学;
【分类号】：R378.3
【正文快照】： *?霍乱(Cholera)是一种烈性、急性腹泻疾病,其发病急剧、传播快、影响大,被世界卫生组织确定为国际检疫传染病[1-3],霍乱弧菌(Vibrio cholerae)作为该病的病原体倍受关注[4]。研究表明,霍乱弧菌具有复杂、高效的基因表达调控系统,可以在不同的环境条件下对一系列基因进行相应，

本文编号：1211772