低温保存对小鼠骨髓源树突状细胞生物特性的影响

发布时间：2017-12-03 10:30

  本文关键词：低温保存对小鼠骨髓源树突状细胞生物特性的影响

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【摘要】：目的：探讨两种不同低温保存方法对小鼠骨髓源树突状细胞生物特性的影响。方法：1、小鼠骨髓源树突状细胞的培养与分组颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠,在无菌条件下获得小鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液,分成三组：A组(常规培养)、B组(早期冻存)及C组(培养后冻存),其中A组单细胞悬液加入rmGM-CSF和rmIL-4后分装于2个透气培养瓶培养,48小时后离心去除上清液,并补充含12% FBS的RPMI 1640全培养液和细胞因子继续培养,B组单细胞悬液直接冻存,C组前5天培养同A组,第5天经自然沉降后收集悬浮细胞用于冻存。2、细胞的冻存与复苏后培养用于冻存的细胞经洗涤、离心后,重悬于自制冻存液(70% RPMI 1640全培养液,20% FBS,10% DMSO),在-20℃下保存1小时后转移到-80℃超低温冰箱,24小时后转移到液氮罐中,4周后复苏。B组复苏后按A组步骤继续培养出DCs。C组制成单细胞悬液,加入rmGM-CSF和rmIL-4,继续培养一天,换液后并再次补充细胞因子,隔日后收集细胞悬液。3、观察细胞存活率将复苏后的B、C两组细胞用台盼蓝染色法计算DCs存活率。细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。4、流式细胞仪检测小鼠骨髓源树突状细胞分子表型分别收集各组DCs悬液,按照流式抗体说明书进行抗体及其同型对照标记,流式细胞仪检测各组细胞表面CH11c、CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表达。5、CCK-8法检测混合淋巴细胞反应(MLR)无菌条件下取BALB/c小鼠脾脏并剪碎,经研磨、过滤后得到细胞悬液,用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞,尼龙毛柱法获得同种异体T细胞。取上述方法获得的各组成熟树突状细胞,加入丝裂霉素C在37℃下孵育45min,洗涤后,按1：5、1：10、1：20、1：40的比例分别将DCs和T细胞加入96孔板,每组设置3个复孔,同时设DCs和T细胞作阴性对照,培养液作为空白对照,两者共培养68h后,每孔加入10μl CCK8溶液,继续培养4h后,用酶标仪测定450nnm处各孔OD值(optical density)。6、Elisa法检测培养上清中IL-10、TGF-β1水平收集上述各组未成熟DCs细胞上清液,按Elisa试剂盒说明书步骤测定培养上清液DL-10、TGF-β1水平。结果：1、两组经过冻存的DCs复苏后存活率分别为(85±3.9)%和(83±6.1)%,存活率无统计学差异,P0.05；2、三组DCs均高表达CDllc,低表达CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子；3、混合淋巴细胞反应提示B、C两组DCs刺激同种异基因T细胞增殖的能力与A组相比较有所下降,但差异无统计学意义(P0.05)；4、三组培养上清液中IL-10、TGF-β1水平的差异亦无统计学意义(P0.05)。结论：经过低温保存的imDCs和小鼠骨髓细胞经低温保存后分化成的imDCs仍能保持稳定的生物学特性,可以用于小鼠动脉粥样硬化的细胞免疫治疗。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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