A类清道夫受体内吞路径的研究

发布时间：2017-12-27 11:46

本文关键词：A类清道夫受体内吞路径的研究　出处：《南京医科大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：A类清道夫受体(Class A scavenger receptor, SR-A)是一种主要表达于巨噬细胞的模式识别受体,在机体的自然免疫中发挥重要作用。SR-A还与多种疾病的发生密切相关,其调控的异常是许多重要疾病的重要病理生理学基础。SR-A主要以吞噬多种多样的配体而实现自身的功能。然而,SR-A内吞路径的分子机制目前尚不知晓。本课题分别应用SR-A的两个特异性配体—乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)和岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan),深入探讨了SR-A的不同内吞路径及其耦联的下游信号通路,揭示了不同内吞路径所具有的生物学意义,为阻止巨噬细胞凋亡、防止脂质在细胞中的过度积聚提供了新的干预靶点。细胞膜受体介导的受体配体复合物的内吞主要有两种形式:网格蛋白依赖型和小凹蛋白依赖型内吞路径。本课题首先想澄清,SR-A的内吞路径是什么?我们通过免疫共沉淀实验证实,SR-A在RAW264.7巨噬细胞中可以分别与网格蛋白或者小凹蛋白-1相互结合。进一步应用间接免疫荧光实验观察到,SR-A与网格蛋白或小凹蛋白-1共定位于RAW264.7细胞中。上述结果提示,SR-A可能同时依赖两种内吞路径进入细胞。接着我们想知道,SR-A这两条内吞路径的生物学意义是什么?为此,我们分别运用了两种方法特异性地阻断这两条内吞路径:一是通过SiRNA分别下调两条内吞路径中的关键结构蛋白—网格蛋白和小凹蛋白-1,从而阻断相应的内吞路径;二是运用特异性化学阻断剂氯丙嗪(CP)或nystatin,分别直接阻断相应的内吞路径。结果我们发现,当用SiRNA的方法网格蛋白下调约65%后,流式检测RAW264.7细胞内吞acLDL的能力约被抑制60%,而小凹蛋白-1表达下调约60%时,acLDL的内吞大约抑制25%。使用内吞化学阻断剂重复这一实验,得到了基本一致的结果,说明acLDL可能主要通过网格蛋白路径进入细胞。SR-A的另一重要功能为介导巨噬细胞的凋亡,为此我们还用同样的方法检测了不同内吞路径对SR-A介导的巨噬细胞凋亡的影响。结果显示,当网格蛋白下调时,SR-A介导的巨噬细胞凋亡减少约11%-16%;而小凹蛋白-1表达下调时,SR-A介导的巨噬细胞凋亡下降约58%-78%。因此,SR-A介导的巨噬细胞凋亡可能主要通过小凹蛋白路径实现。为了进一步阐明SR-A内吞路径耦联的下游信号通路,我们又进行了以下研究。首先,我们分别检测了acLDL和岩藻多糖分别与受体结合以及随后的内吞两种情形下SR-A下游信号分子的激活情况。Western blot检测发现,在内吞时无论acLDL还是岩藻多糖都可以激活MAPKs (p38, JNK, ERK)三个信号分子;但在配体与受体仅仅结合而不发生内移的情况下(细胞置于4℃条件下),则只见acLDL可以激活MAPKs(p38, JNK, ERK)家族信号分子,而岩藻多糖却不能激活上述信号分子。因此,本研究在后续的内吞试验中只选用配体岩藻多糖,以避免配体与受体结合时可能激发的信号影响。使用SiRNA和化学阻断剂分别阻断特定的内吞路径后,再检测岩藻多糖对MAPKs(p38, JNK, ERK)信号分子激活的影响,结果表明,当阻断网格蛋白内吞路径后,岩藻多糖激活的ERK信号分子受到明显抑制,p38和JNK信号分子激活不受影响;当阻断小凹蛋白内吞路径后,岩藻多糖激活的p38和JNK信号分子会受到明显抑制,而ERK信号分子的激活不受影响。这就提示,SR-A网格蛋白内吞路径可能与ERK信号通路相耦联,而小凹蛋白内吞路径与p38和JNK信号通路相耦联。最后,我们想进一步明确SR-A耦联的下游信号通路和功能之间的关系。在研究中我们分别使用了p38、JNK和ERK三个信号分子的化学抑制剂(SB203580,SP600125,PD98059)来特异性地抑制这三个信号分子的激活,随后观察对SR-A依赖性的巨噬细胞凋亡的影响。实验观察发现,当p38和JNK激活受到抑制后,SR-A介导的巨噬细胞凋亡也明显受到抑制;而ERK信号抑制后则无此现象出现。因此,p38和JNK信号通路可能为SR-A依赖性的细胞凋亡所必需。总之,本课题研究结果显示,SR-A作为巨噬细胞表面的一类重要受体蛋白,同时具备网格蛋白依赖型和小凹蛋白依赖型两种内吞路径。其配体岩藻多糖经由小凹蛋白路径内吞时,通过激活下游的p38和JNK信号途径,进一步引起SR-A依赖性巨噬细胞凋亡。如果岩藻多糖通过网格蛋白路径内吞时,则激活下游ERK信号分子,其具体的生物学意义尚不明了。SR-A介导的脂质内吞主要通过网格蛋白内吞路径。上述研究结果从分子水平上解释了SR-A功能多样性的结构基础:由于存在不同的内吞方式,使得SR-A在与不同的配体甚至是同一种配体发生反应时,通过选择不同的内吞通路,表现出特定的生物学功能。由于SR-A在调控巨噬细胞多项重要功能的过程中发挥重要作用,因此对于SR-A内吞路径的阐明,有利于今后更加深入地认识SR-A选择性调控机制,并为相关重要疾病的诊治提供了新的靶点。
[Abstract]:Class A scavenger receptor (SR-A) is a pattern recognition receptor mainly expressed in macrophages, and plays an important role in the body's natural immunity. SR-A is also closely related to the occurrence of a variety of diseases, and the abnormality of its regulation is the important pathophysiological basis of many important diseases. SR-A realizes its own function mainly by phagocytosis a variety of ligands. However, the molecular mechanism of the SR-A endocytosis path is not yet known. This paper applied two SR-A specific ligand - acetylated low density lipoprotein (acLDL) and fucoidan (fucoidan), discussed the SR-A different endocytic pathways and the coupled signaling pathway to reveal the biological significance of different endocytic pathways of macrophage apoptosis, in order to prevent. Provide new targets for intervention to prevent excessive accumulation of lipid in the cell.
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

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