工程化的人抗人IgE抗体的制备

发布时间：2017-12-28 13:03

本文关键词：工程化的人抗人IgE抗体的制备　出处：《复旦大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：重组人IgE C3-C4抗原,获得其特异性的高亲和力工程化的人抗体及人源化的鼠单克隆抗体。方法：用PCR的方法获得人IgE C3-C4基因,与原核表达载体pET-19b连接得到表达质粒并在大肠杆菌BL21(DE3) star pLysS中大量表达并纯化。构建人免疫球蛋白G基因文库,并用重组的IgE C3-C4抗原借助克隆印记法对基因文库进行筛选以获得特异性的高亲和力抗体,然后用ELISA、Western blotting、Biacore及组胺释放抑制试验等方法检测其反应性,并对抗体进行链替换和点突变以寻求更高的亲和力；同时用重组的IgE C3-C4抗原免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞,通过小鼠腹腔注射的方法从腹水中获得大量鼠单克隆抗体,检测其反应性并初步进行鼠单克隆抗体的人源化。结果：成功制备了反应性好的重组人IgE C3-C4抗原,成功构建了非依赖性克隆滴度为9×107的人免疫球蛋白G基因文库；用克隆印记法从所构建的基因文库中筛选到一个特异性的抗IgE C3-C4的抗体,体外试验检测其反应性好；获得了一个链替换和三个点突变抗体,反应性与原始抗体相当；获得了5株对重组IgE C3-C4抗原特异性反应的杂交瘤细胞株,对其中2株分泌的单克隆抗体进行初步人源化。结论：利用重组的人IgE C3-C4抗原从人免疫球蛋白G基因文库中筛选到一个特异性抗体,反应性好；用杂交瘤的方法获得的鼠单克隆抗体反应性亦很好,均可进行进一步的体内外试验以开发其应用价值。目的：溶组织内阿米巴感染在发达国家和发展中国家中都会引起比较严重的疾病,为了对我国溶组织内阿米巴的感染的血清流行病学情况有大致了解,特进行此次调查。方法：提取溶组织内阿米巴HK9株滋养体的粗抗原；构建表达质粒pET-19b-Igl-C,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中对Igl-C(溶组织内阿米巴滋养体表面半乳糖／乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素中间亚单位的C末端,可用于血清学诊断)进行大量表达并纯化；随后使用这两种抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对总共1312份血清样本进行检测,最后再根据统计数据建立logistic回归模型,起到总结和预测发病概率的作用。结果：提取了溶组织内阿米巴滋养体粗抗原并大量表达了Igl-C蛋白,使用这两种蛋白进行了ELISA检测。共检测1312份血清(男：678,女：634),各省基于Igl-C检测的感染率为：北京：1.06%(2/188),上海：3.85%(5/130),四川：7.04%(10/142),广西：3.17%(6/189),贵州：14.39%(41/285),青海：0.53%(1/190),新疆：9.04%(17/188)。根据此结果得出logistic回归模型：结论：本调查是我国第一次关于溶组织内阿米巴在健康人群中的感染情况的血清流行病学调查,其结果与1988-1992年的第一次全国人体寄生虫病分布情况调查的结果一致；所得的logistic回归模型与数据贴合,并能根据血清样本的基本资料(性别、年龄、地域等)进行验前概率的推测。目的：对无经验的工作人员来说,仅从形态学鉴定螨类十分困难,本研究旨在使用一种简便易行的方法来鉴别常见无气门螨类。方法：先对螨类进行形态学鉴定以确定其种类,然后用CTAB裂解法抽取其基因组DNA;随后用PCR的方法扩增其内转录间隔区2(ITS2)和细胞色素氧化酶亚单位I(COI)基因,与测序载体连接后进行测序。经测序后先用ClustalX软件进行序列对齐,再用PHYLIP软件计算遗传距离,构建邻近型系统发生树,并用PAUP软件构建最大简约型系统发生树。结果：成功获得了6种螨(椭圆食粉螨Aleuroglyphus ovatus,热带无爪螨Blomia tropicalis,粉尘螨Dermatophagoides farina,户尘螨Dermatophagoides pteronyssinus,埋内欧尘螨Euroglyphus maynei,腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae)的ITS2基因,长度从316bp到488bp不等,基于ITS2计算所得各种螨种内遗传距离为0.00-0.077844,种间遗传距离为0.202426-0.912959；成功获得5种螨(椭圆食粉螨Aleuroglyphus ovatus,热带无爪螨Blomia tropicalis,粉尘螨Dermatophagoides farina,户尘螨Dermatophagoides pteronyssinus,腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae)的COI基因,长度为377bp或378bp,基于COI计算所得种内遗传距离为0.000--0.029748,种间遗传距离为0.138403-0.279304；利用ITS2和COI基因构建了分子进化树,可起到种类鉴别的作用。结论：在形态鉴别困难的情况下,ITS2基因和COI基因可作为分子标记用于鉴别无气门螨类。
[Abstract]:Objective: to restructure human IgE C3-C4 antigen and obtain its specific high affinity engineered human antibody and humanized mouse monoclonal antibody.
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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