减阻剂对大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影响

发布时间：2017-12-28 23:06

本文关键词：减阻剂对大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影响　出处：《南方医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景周围血管疾病(Peripheral arterial disease, PAD)是一类临床常见疾病,由于粥样硬化斑块、血栓、动脉炎症等原因造成的动脉狭窄或闭塞,发病机理包括血液微循环、流变学、血小板功能、凝血机制、免疫、代谢等方面的异常。大血管狭窄或闭塞后,其供血区的骨骼肌发生缺血损伤,进而导致静息痛、间歇性跛行、肢体坏疽等一系列临床症状。目前治疗方法包括溶栓、外科手术、介入取栓等,可以起到开通大血管的作用,而对于大血管闭塞后微循环的损伤缺少良好的治疗手段。治疗性血管新生是通过人为的向局部缺血组织输送血管生长因子、基因或重组蛋白的方式促进血管新生,从而改善缺血组织的缺血缺氧状态。近年来该研究取得了一定的成果,但是这类生长因子在诱导血管再生的过程中,其不可控的促血管再生效应可能出现许多并发症,目前临床应用仍很局限。那么,寻找其他的治疗手段就显得很有意义了。血管发生(neovascularization)包含血管新生(angiogenesis)和小动脉形成(arteriogenesis)。血管新生的驱动因素是缺氧,而动脉形成的始动因素是血流切应力(fluid shear stress, FSS)的增加。猪急性股动脉闭塞的模型中,在闭塞远端造成人工动-静脉瘘,发现可促进更多侧支循环的建立,局部血运状态的改善情况明显优于促血管生长因子的作用。表明持续增加缺血组织的血流切应力能明显促进局部小动脉形成。那么,能否通过增加血流剪切力促进小动脉形成来治疗缺血性疾病呢? 1948年英国科学家Toms报导了Toms现象(Toms phenomenon)他发现一类特殊可溶性高分子聚合物,它可以在不影响流体粘滞度的同时明显减少管道液体的流动阻力,这类高分子聚合物被称为“减阻剂”(Drag-reducing polymers, DRPs)。至今,减阻剂已经广泛应用于医学研究、石油、消防、灌溉、航海等领域。近年来减阻剂在医学领域倍受关注,已先后证明减阻剂具有改善急性心肌缺血动物预后、改善失血性休克微循环灌注、改善糖尿病动物微循环障碍等方面的作用,并能通过增加血流剪切力的作用减少动脉粥样硬化斑块的形成。表明减阻剂在缺血性心血管疾病、失血性休克、动脉粥样硬化等循环系统疾病的治疗方面有很大的发展前景。我课题组证实PEO能促进大鼠急性后肢缺血骨骼肌血流灌注的恢复,并直接观察到PEO可提高微动脉血管壁的切应力30%,表明DRPs可以提高缺血组织的血供状况,为急性缺血疾病治疗提供新的思路,并为进一探讨DRPs恢复慢性缺血组织血供提供了基础,但是目前除了减阻剂干预动脉粥样硬化斑块形成的研究外,减阻剂的研究都局限于急性血管闭塞、狭窄或失血性休克等状态血流动力学的改变,而慢性缺血性疾病的研究尚未见报道,能否利用PEO增加血流剪切力的作用来治疗缺血性疾病呢? 本实验拟通过超声造影方法测定微循环血流量,观察PEO对外周动脉完全闭塞情况下慢性缺血骨骼肌微循环灌注的影响,并探讨减阻剂通过提高血流剪切力促进缺血组织动脉生长(arteriogenesis)的可能性。第一部分：对比超声定量大鼠后肢骨骼肌绝对血流量的研究 [目的] 建立“应用对比超声技术定量大鼠骨骼肌绝对血流量”的方法学,并评价该方法的稳定性及可重复性。 [方法] 1、动物准备 SPF级Wistar雄性大鼠12只,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,大鼠心前区及左侧后肢备皮,仰卧固定于鼠板上。 2、超声造影剂全氟丙烷人血白蛋白微泡注射剂(“全氟显”),浓度约为(1.0～2.0)×109/ml,微泡大小2.0～4.0μm,实验时以0.9%氯化钠注射液3ml稀释并摇匀待用。 3、造影方法使用Sequoia512超声诊断仪(17L5探头),将探头定位在左室短轴切面,通过输液泵持续滴注造影剂“全氟显”(20μl/min)达稳态浓度后,以对比脉冲序列模式(Coherent Pulse Sequence, CPS), R波触发间歇成像取图；再将超声探头定位在大鼠后肢中部(髌骨和踝关节连线中点),参数保持不变,以时间触发(间隔500ms)成像,当静注造影剂(200μl/min)至充盈达稳态稳定后,以高机械指数破坏造影剂微泡后开始存取骨骼肌组织内造影剂再充填过程的全部图像。 7天后按照上述的实验步骤再重复一次造影。 4、骨骼肌血流量的计算方法造影图像脱机使用MCE分析软件(OHSU, USA)分析,测定左室心腔造影稳态时的平均声学强度ALV,骨骼肌造影的声学平台强度Am及造影剂再填充速率βm。大鼠骨骼肌肌肉密度pm=1.05g/ml,本实验中骨骼肌造影所用造影剂浓度为心腔造影所用浓度的10倍,故大鼠骨骼肌的绝对血流量为60×βm×Am/(ALV×10)/1.05(单位：ml·g-1·min-1)。 [结果] 经静脉注射“全氟显”后,大鼠心腔和后肢骨骼肌均获得满意的显像效果。同一只大鼠先后两次造影得出的骨骼肌毛细血管容积,血流速度及标化计算后的骨骼肌的血流量统计学上未见显著性差异(P0.05)。超声造影定量血流参数曲线的拟合优度良好,决定系数为0.944±0.046(0.789～0.985),P0.01。 [结论] 以左室腔声学造影强度为参照行声学造影检查能准确定量大鼠后肢骨骼肌的绝对血流量,该方法具有良好的重复性和稳定性,可视为一种在活体定量肌肉组织绝对血流量的新方法。第二部分：减阻剂对大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影响 [目的] 建立大鼠慢性后肢骨骼肌缺血模型,通过静脉给予药物治疗,应用超声造影方法测量大鼠后肢骨骼肌的血流量变化及应用免疫组化方法研究血管的变化,评价减阻剂对大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影响,并初步探索减阻剂增加血流灌注的机理,为构建缺血性疾病新的治疗手段奠定基础。 [方法] 1、减阻剂的配制方法： PEO溶解于生理盐水中成0.1%的浓度,放置于分子截留量为50KDa的透析袋中透析24小时,使用小过滤器(孔径0.2μm)将溶液中的细菌滤除后,用凝胶渗透色谱法测定溶液中PEO的分子量为4.99×106Da,生理盐水稀释成50ppm的浓度待用。 2、大鼠输液通道的建立：麻醉状态下分离颈静脉,插入静脉留置导管,将导管用缝线在皮下多处固定后,经皮下隧道引导至背部切口并固定。大鼠分笼饲养,每日予0.1ml肝素生理盐水(10iu/ml)冲管。 3、大鼠单侧后肢慢性缺血模型的建立：输液通道建立后3天,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。沿大鼠右侧后肢腹股沟韧带下缘做—1 cm长切口,分离右股动脉及其分支剥离并以5-0细丝线结扎后切断,避免伤及静脉及神经,左侧后肢不做处理。 4、给药方法：将大鼠随机分成两组,于缺血后第1、3、5、7、9、11、13天清醒自由活动状态下通过输液通道给药,治疗组予减阻剂(30min,给药速度以体重计算血容量,使血中PEO浓度达到2μg/ml),对照组予以相同的速度相同时间给予生理盐水,治疗结束后予0.1ml肝素盐水(10iu/ml)冲管,小钢丝封闭输液导管。 5、声学造影评价大鼠后肢骨骼肌血流：于术前及术后第1、3、7、14、21、28天行声学造影检查,方法同第一部分。 6、血流储备检测：于第28天行平静状态下声学造影检测后,持续滴注“全氟显”(200μl/min),造影模式和参数不变,使用临时起搏器刺激大鼠后肢骨骼肌(频率为120次/分)2分钟后,开始取图。脱机使用MCE软件分析图像,记录A、p及A×β值。血流储备即为起搏后的A×β值与起搏前的A×β值的比值。 7、病理学检测：第28天行超声造影后予较大量的麻药处死动物,行HE染色及α-actin抗体免疫组化染色。 [结果] 4周后,减阻剂治疗组大鼠缺血后肢的血流量显著高于盐水对照组(0.319±0.044 vs 0.211±0.040ml/g/min,P=0.001)；减阻剂治疗组慢性缺血后肢的血流储备亦高于盐水对照组(3.227±0.941 vs 1.867±0.551,P=0.012)；减阻剂组大鼠后肢缺血的骨骼肌血管容积较生理盐水组比较有显著增加(0.446±0.111 vs 0.310±0.059,P=0.024)；HE染色提示：大鼠非缺血后肢骨骼肌细胞形态正常,无充血、水肿,盐水组及减阻剂组的缺血骨骼肌中均有炎症细胞浸润,盐水组骨骼肌细胞可见水肿,而减阻剂组的细胞未见明显水肿；免疫组化提示减阻剂组的每高倍镜下小动脉个数较盐水组的多(9.25±1.72 vs 6.23±0.86,P=0.026)。 [结论] 减阻剂能增加大鼠慢性缺血后肢的血流量及血流储备,免疫组化提示减阻剂组的小动脉数量较盐水组多,提示减阻剂可促进缺血后肢的血管新生及动脉形成过程。
[Abstract]:background
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

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