金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素（PVL）对多形核粒细胞的影响

发布时间：2017-12-28 23:31

本文关键词：金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素（PVL）对多形核粒细胞的影响　出处：《安徽医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是危害人民生命健康的超级细菌,产PV-杀白细胞毒素(PVL)的MRSA毒力增强,危害更广,可引起社区人群的严重感染。临床研究发现,产PVL的MRSA所引起的坏死性肺炎病情进展快,治疗困难,死亡率高,常伴有多核形粒细胞(PMNs)在呼吸道表面聚集,发生严重的炎症反应,但其机制尚不清楚。本课题将诱导含重组表达载体的宿主菌表达,纯化获得重组PVL蛋白(rPVL),观察rPVL对人PMNs的杀伤作用,探讨rPVL对PMNs细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α表达的影响,并探讨其胞内信号传导通路,同时研究rPVL对不同种属来源的PMNs的杀伤作用,为阐释PVL的致病机制,寻求治疗PVL相关肺损伤的新靶点提供理论依据。方法:(1)异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含重组表达载体的大肠埃希菌(E.coli) BL21(DE3)株,纯化后获得可溶性重组蛋白,Western blot对其鉴定。(2)从正常人外周血分离PMNs,分别加入6nmol/L,100nmol/L rPVL蛋白,共同孵育6h,台盼兰染色观察细胞活力,瑞氏吉姆萨染色观察细胞形态,透射电子显微镜观察细胞超微结构,流式细胞法检测细胞凋亡/坏死率。同时,分离人、新西兰白兔、BALB/c小鼠、C57/ BL6小鼠的PMNs,分别加入PBS和20nmol/L rPVL蛋白,共同孵育4h,台盼兰染色观察细胞活力,瑞氏吉姆萨染色观察细胞形态,流式细胞法检测细胞凋亡/坏死率。(3)收集细胞,提取总RNA,应用RT-PCR法检测细胞IL-6、IL-8、TNF-α、TLR2、TLR4、CD14 CXCR4及NF-κB p65 mRNA表达。同时收集细胞培养上清,ELISA法检测IL-6、IL-8及TNF-α浓度变化。结果:(1)经IPTG诱导后, SDS-PAGE鉴定可获得到与预期分子量相符的表达产物。亲和层析法纯化的rPVL-F和rPVL-S,经Western-blotting鉴定,能够被鼠源性抗His抗体识别。(2)rPVL作用后,台盼兰染色可见人、新西兰白兔及BALB/c小鼠的PMNs着色细胞增多,瑞氏吉姆萨染色可见细胞中出现不规则团块样物,核固缩,细胞形态缩小,部分细胞胞浆可见空泡,核碎裂。电镜检查可见rPVL作用后,细胞核固缩,胞浆空泡增多,并可见凋亡小体。流式细胞仪检测发现,相较之于PBS对照组,rPVL组细胞凋亡率和坏死率均明显升高,具有统计学意义。而C57/BL6小鼠的PMNs在rPVL作用前后,细胞活力、形态学及凋亡和坏死率均无变化。(3)rPVL作用PMNs后,细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α浓度及mRNA表达量明显增加,且随着浓度升高,增加更为明显。PMNs TLR2、TLR4及其相关信号通路分子CD14、CXCR4 mRNA表达量均增高。同时,PMNs NF-κB p65 mRNA表达量也明显增高。结论:(1)成功建立了PVL基因高效表达体系,经亲和层析纯化法可获得重组蛋白,为研究PVL分子致病机制奠定基础。(2)rPVL对人PMNs具有特异性杀伤作用,可诱导PMNs凋亡,甚至坏死,使得细胞活力减低,形态改变。同时,对不同种属来源的PMNs,显示出不同的杀伤作用。(3)rPVL能促进PMNs细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达,同时,可上调PMNs TLR2、TLR4表达,提示rPVL可通过TLR信号传导通路,促进NF-κB活化,进而促进细胞因子的表达和分泌。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

【引证文献】