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干扰Apg-2基因在BaF3-p210及BaF3-p210-T315I中的作用研究

发布时间:2017-12-29 01:02

  本文关键词:干扰Apg-2基因在BaF3-p210及BaF3-p210-T315I中的作用研究 出处:《重庆医科大学》2012年硕士论文 论文类型:学位论文


  更多相关文章: RNA干扰 Apg-2 增殖 凋亡 耐药


【摘要】:目的热休克蛋白Apg-2属HSP70亚家族,广泛地分布于各种真、原核细胞,在细胞增殖和凋亡过程中发挥重要作用,但在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中的作用尚不清楚。在我们的前期蛋白质组学研究中发现,H2O2诱导空载质粒pMIGR1感染的小鼠前B淋巴细胞(BaF3-MIGR1)和稳定表达Bcr-Abl融合基因的BaF3-p210细胞(简称Bp210)损伤过程中,Apg-2蛋白呈现高表达状态。过表达Apg-2基因可促进Bp210细胞增殖,并保护其免受H2O2诱导的DNA损伤。本课题拟采用RNA干扰技术,在Bp210、Bp210-T315I(耐STI571)及BaF3-MIGR1细胞内靶向抑制Apg-2基因,研究其对三株细胞的影响,为CML治疗提供一个新的靶点。 方法(1)构建靶向沉默Apg-2基因的shRNA(Hsp41-43)质粒及作为阴性对照的无序shRNA(HspHK)质粒,采用电穿孔方法将shRNA质粒转入BaF3-MIGR1, Bp210和Bp210-T315I细胞中,经G418加压培养筛选出Apg-2基因稳定抑制的细胞株,采用RT-PCR和Western-blot检测Apg-2mRNA和其蛋白的表达水平,筛选抑制效果最佳的细胞株做后续试验。(2)采用Am-blue和克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞仪(FCM)分析细胞周期;瑞氏染色和FCM检测细胞凋亡,Western-blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2蛋白的表达。(3)STI571处理后,Am-blue和克隆形成实验检测细胞增殖,瑞氏染色和FCM检测细胞凋亡。 结果(1)成功筛选出稳定抑制Apg-2基因的细胞株BaF3-MIGR1-Hspa42、Bp210-Hspa42以及Bp210-T315I-Hspa42,和转染无序shRNA的阴性对照株BaF3-MIGR1-HspaHK、Bp210-HspaHK以及Bp210-T315I-HspaHK。(2)干扰Apg-2表达可抑制Bcr-Abl阳性的Bp210及Bp210-T315I细胞增殖,但对BaF3-MIGR1细胞有促增殖作用;同时能诱导三株细胞发生凋亡。(3)Apg-2的抑制增强了Bp210-T315I对STI571的敏感性,,细胞存活率降低,凋亡率增加。 结论本研究证明干扰Apg-2基因的表达可抑制Bcr-Abl阳性细胞Bp210及Bp210-T315I的增殖,但对Bcr-Abl阴性细胞BaF3-MIGR1的作用却与此相反。抑制Apg-2的表达可通过下调Bcl-2的表达促进细胞凋亡,降低Bp210-T315I对STI571的耐药,为进一步研究提供了实验依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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