永生化胎猪胰腺源间充质干细胞株的建立及向胰岛素分泌细胞分化

发布时间：2017-12-29 05:06

本文关键词：永生化胎猪胰腺源间充质干细胞株的建立及向胰岛素分泌细胞分化　出处：《西北农林科技大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：糖尿病是继心血管疾病和癌症之后的第三大高发慢性疾病,它还会导致多种并发症的发生,如眼疾、肾脏疾病、神经系统疾病、心脑血管疾病及糖尿病高渗综合症等。猪胰岛因组织来源丰富,胰岛素结构与人相似,且能在人体血清内存活发挥特定的生理性血糖调节作用,可以作为新的可替代的供体细胞来源。但是胰腺内胰腺干细胞的数量相对较少,而且该细胞长期处于生长阻滞期,这样胰腺干细胞的增殖能力受到了极大的限制。本研究旨在通过酶消化胎猪胰腺组织分离出胰岛样细胞团,单克隆扩增出间充质干细胞,进一步转染人的端粒酶基因获得永生化胎猪胰腺源间充质干细胞株,对该细胞株进行生物学特性检测,判断其是否具有胰腺干细胞的相关特性,能否用于糖尿病胰岛β细胞受损的替代治疗。 1.永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的分离培养及生物学特性本研究采用先悬浮后贴壁的方法从2.5~3月龄胎猪胰腺组织中分离出间充质干细胞,转染hTERT,单克隆出永生化胎猪胰腺源间充质质干细胞株,体外多次传代后仍然保持很强的增殖活力(100代以上),通过细胞生长曲线的绘制、流式细胞仪分析表面抗原、免疫荧光/组化染色、RT-PCR检测、成瘤性检测以及体外可定向诱导分化等方法,对该细胞的生物学特性进行了系统鉴定,证明其具有经典间充质干细胞和部分胚胎干细胞的生物学特性,并具有定向分化为类神经、心肌和生殖细胞的潜力,将其移植入裸鼠体内未观察到成瘤现象。 2.永生化胎猪胰腺源间充质干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化建立了一个体外两步法向胰岛素分泌细胞定向分化的诱导分化方案,第一步:添加10 mmol/L尼克酰胺、100 ng/mL ActivinA、20 ng/L EGF和20 ng/L bFGF的方法先贴壁诱导4 d,随后将其移至低粘附性培养皿中继续诱导3 d;第二步:撤去EGF和bFGF,添加10 nmol/L Exendin4和4 nmol/Lβ-细胞素(BTC),继续悬浮诱导1 w,将永生化胎猪胰腺源间充质干细胞诱导成胰岛样细胞团。诱导后的细胞团呈DTZ、PDX1、Insulin、C-peptide阳性。高低糖刺激后,诱导的细胞具有良好的葡萄糖反应性,能够分泌胰岛素和C-肽。通过注射STZ的方法,建立小鼠糖尿病模型,将诱导后的细胞移植入糖尿病模型小鼠体内后,可2 w内缓解糖尿病模型小鼠的高血糖状况。将永生化胎猪胰腺源间充质干细胞移植入小鼠睾丸,切片染色检测发现该细胞可以在体内自发分化为生殖细胞和在高糖状况下自发分化为胰岛素分泌细胞。 3. GSK3抑制剂-BIO调控永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的增殖体外添加BIO后,通过免疫荧光染色、QRT-PCR检测、Western-blotting、荧光素酶活性分析、BrdU增殖分析及细胞凋亡(Tunel染色分析),初步认为永生化胎猪胰腺源间充质干细胞通过Wnt/β-catenin信号通路能够促进其增殖,但通过QRT-PCR检测和葡萄糖刺激反应等实验证实BIO在该细胞向胰岛素分泌细胞分化的过程中无显著效用,因而认为BIO能够促进永生化胎猪胰腺源间充质干细胞的增殖并保持其未分化的状态。上述结果表明,永生化胎猪胰腺源间充质干细胞具有很强的体外增殖能力,体外能够向其他类型细胞进行分化,可以为组织工程和再生医学的研究提供足够的细胞资源。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】