分解肌酐、尿酸基因工程菌的构建及其功能研究

发布时间：2017-12-29 12:24

  本文关键词：分解肌酐、尿酸基因工程菌的构建及其功能研究　出处：《中南大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一章分解肌酐、尿酸基因工程菌的构建 目的：构建肌酐水解酶基因和尿酸氧化酶基因的联合基因,并将其克隆入保加利亚乳酸杆菌,构建能高效表达肌酐水解酶和尿酸氧化酶的乳酸菌基因工程菌。 方法：利用基因融合的方法将尿酸氧化酶和肌酐水解酶进行融合,经过测序鉴定后将其连接质粒PNZ8048构建成重组质粒PNZ8048-U-C,并转化至大肠杆菌DH5α,进行筛选鉴定,提取重组质粒PNZ8048-U-C,电穿孔转化保加利亚乳酸杆菌,筛选鉴定转化子,并制备粗酶液进行SDS-PAGE分析检测蛋白大小。 结果： 1.利用基因融合的方法将尿酸氧化酶和肌酐水解酶进行融合所构建的联合基因片段U-C经过测序鉴定与Genbank中尿酸氧化酶和肌酐水解酶的序列一致。 2.成功构建重组质粒PNZ8048-U-C,将质粒进行双酶切,电泳显示两酶切片段大小分别约为3.3Kb和1.6Kb,与理论值符合。 3.利用电转化的方法成功将重组质粒PNZ8048-U-C转化保加利亚乳酸杆菌,经SDS-PAGE分析,重组保加利亚乳酸杆菌表达重组蛋白的分子量约为61KD,按基因序列图分析肌酐水解酶253个氨基酸,而尿酸氧化酶基因含303个氨基酸,因此我们推测肌酐水解酶和尿酸氧化酶的联合基因片段含氨基酸为556左右,其分子量约为61KD。 结论： 1.成功构建尿酸氧化酶和肌酐水解酶联合基因片段。 2.成功利用电转化技术将含尿酸氧化酶和肌酐水解酶联合基因的质粒PNZ8048-U-C成功转化保加利亚乳酸杆菌,经电泳和基因序列分析符合理论值。 第二章保加利亚乳酸杆菌基因工程菌的遗传稳定性及尿毒素分解能力的体外研究 目的：探索保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-uc对ESRD患者血清中肌酐和尿酸的分解能力,重组质粒PNZ8048-U-C的遗传稳定性以及乳酸菌粗酶液的活性,对基因工程菌的功能学进行进一步的探索,并为进一步的体内研究奠定基础。 方法：根据文献经典的检测质粒遗传稳定性的方法对重组质粒PNZ8048-U-C在有无氯霉素抗性的选择压力的条件下分别将其进行传代100代,检测其遗传稳定率。制备保加利亚乳酸杆菌基因工程菌的粗酶液,测定其中尿酸氧化酶和肌酐水解酶的活性。收集我院慢性肾功能不全CKD5期患者共20例,将其血液进行离心收集上清液,考察保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-UC对终末期肾衰竭患者血清中肌酐和尿酸的分解能力。 结果： 1.将重组质粒PNZ8048-U-C在有无氯霉素抗性的选择压力的条件下分别将其进行传代100代,其遗传稳定率均维持在98%以上,表明重组质粒具有良好的遗传稳定性,且不受氯霉素的影响。 2.保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-Uc的粗酶液中尿酸氧化酶的活性为0.86u/ml,较产朊假丝酵母菌粗酶液活性增加。基因工程菌粗酶液肌酐水解酶的活性为0.83u/ml,较斯氏假单胞菌A1501中肌酐水解酶的活性增加。 3.保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-uc对慢性肾功能不全CKD5期患者血清中肌酐和尿酸具有较强的分解力。 结论： 1.重组质粒PNZ8048-U-C在保加利亚乳酸杆菌中具有良好的遗传稳定性,且其稳定遗传与氯霉素无明显相关性。 2.保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-UC粗酶液中肌酐水解酶和尿酸氧化酶活性较其各自原始菌株活性明显增高。 3.从体外实验可以证实保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-UC对尿毒素具有较强的分解力。 第三章保加利亚乳酸杆菌基因工程菌治疗慢性肾衰竭大鼠的疗效观察 目的：构建5/6肾切除大鼠模型,初步探讨保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-UC在体内对肌酐、尿酸的分解能力,对血脂代谢的影响及其在慢性肾衰竭进展中的作用。 方法：雌性各半6周龄SD大鼠随机分为5组：1.Sham组(n=8)：行假手术,生理盐水2mL/d,灌胃,1次/天；2.Model组(n=7)：生理盐水2mL/d,灌胃,1次/天；3.L.B组(n=7)：原始保加利亚乳杆菌悬菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d,灌胃,1次/天；4.L.b-UC(Qd)组(n=7)：L.b-UC悬菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d,灌胃,1次/天；5.L.b-uc(BIW)组(n=7)：：L.b-Uc悬菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d,灌胃,2次/周。第2-5组大鼠均行5/6肾切除手术。手术12w.后开始对各组大鼠进行灌胃。分别于给药前和给药后第4周末,收集24h尿液,测定24小时尿量,24小时尿蛋白总量,并眼眶取血,检测血清中总胆固醇和甘油三脂的浓度；于给药前及给药后2、4周末眼眶取血,检测血清肌酐和尿酸的浓度。各组大鼠于给药后4周处死。留取肾脏标本,用HE和Masson染色,观察肾脏组织的病理变化,用免疫组化的方法检测肾组织TGF-β1的表达。 结果： 1.给药前,各组大鼠体重之间比较无显著性差异,第4周末,Model组较Sham组体重明显减轻(P0.01),L.b-UC(Qd)治疗组较Model组体重增加(P0.05)。 2.灌胃治疗前,各5/6肾切除组与sham组大鼠相比,24小时尿量,24小时尿蛋白定量及尿蛋白浓度均明显升高(P0.01)。经灌胃治疗4周后,L.b-UC(Qd)组24小时尿量、24小时尿蛋白定量及尿蛋白浓度均Model组显著性降低(P0.01)。而L.b-UC(Biw)组与Model相比各指标值有所下降,但无明显统计学意义(P0.05)。 3.灌胃治疗前,各5/6肾切除组与sham组大鼠相比,血清肌酐和尿酸水平均明显升高,具有显著性差异(P0.01)；经灌胃治疗2周和4周末,L.b-UC(Qd)组和L.b-UC(Biw)组较模型组肌酐和尿酸水平均显著下降(P0.01)；治疗4周末L.B治疗组血清肌酐和尿酸较模型组出现明显下降(P0.01)。不同频率灌胃的两L.b-UC治疗组相比,2、4周末L.b-UC(Qd)治疗组较L.b-UC(Biw)治疗组肌酐和尿酸水平明显降低(P0.01)。2周末和4周末,L.b-UC治疗组较原始的L.B治疗组,血清肌酐和尿酸下降更明显,具有显著性差异(P0.01)。 4.灌胃治疗前,各5/6肾切除组与sham组大鼠相比,血TG、TC水平均明显高于Sham组(P0.05)。经灌胃治疗第4周末,L.B和L.b-UC(Qd)组TG、TC水平均明显低于Model组(P0.01)。 5. HE、MASSON染色显示：Sham组大鼠肾小球、肾小管大小形态正常,未见小管扩张、间质炎症细胞浸润及纤维增生性改变。造模第16周末Model组部分肾小球体积增大,肾小球系膜基质增多；近端小管上皮细胞刷状缘减少或消失,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性,脱落；间质区可见纤维组织增生。L.b-UC(Qd)组肾小管损伤与肾间质纤维化与Model组比较明显减轻(P0.05)。 6.TGF-β1免疫组化显示：与假手术组相比,5/6肾切除模型组大鼠肾小管TGF-β1的表达明显增强(P0.05),基因工程菌能在一定程度上减少TGF-β1的表达(P0.05)。 结论： 1.慢性肾衰竭大鼠经喂饲保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-Uc能够后能显著降低血肌酐、尿酸水平,且呈现明显的量效关系。 2.导入外源质粒后的保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-Uc降低慢性肾衰大鼠血TG、TC功能未改变。 3.保加利亚乳酸杆菌基因工程菌L.b-UC能够明显降低TGF-β1在肾脏的表达,减轻肾脏间质损伤及纤维化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】

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本文编号：1350292