EHEC变种生物学特性分析与志贺毒素1表达调控研究
本文关键词：EHEC变种生物学特性分析与志贺毒素1表达调控研究 出处：《武汉工业学院》2012年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是重要的人类食源性致病菌，人类一经感染可引起呕吐、腹泻，引发出血性肠炎(Hemorrhagic enteritis，HC)、溶血性尿毒综合症(Hemolytic-uremic syndrome，HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic thrombocyto-penia purpura，TTP)等综合症，严重的可导致病人死亡。以O157:H7血清型为代表的EHEC大肠杆菌致病机理复杂，stx基因、LEE毒力岛上编码紧密粘附素(intimin)的eae基因和大质粒上编码溶血素的hly、ehxA基因等均是EHEC的重要毒力因子。在肠道内产生的志贺毒素Stx1、Stx2是EHEC的主要致病因素。 本实验室在前期研究中筛选出一类少见的EHEC变种，它携带stx1和stx2基因但不产这两种志贺毒素。目前仅日本等少数几家实验室发表了类似的研究报告，该类EHEC变种的志贺毒素基因表达调控机制尚不清楚。本文对该类EHEC变种的生物学特性进行分析，并对其中一株EHEC变种EC169的1型志贺毒素表达调控机制进行了初步研究。 本文采用RPLA检验试剂盒检测EHEC变种EC130和EC169的志贺毒素滴度，结果表明它们均不产志贺毒素；PCR检测证实这两株EHEC变种均含有stx1、stx2、eae、hly毒力基因。PCR扩增rfbO157基因、fliCH7基因，结合血清学方法鉴定出EC169为O157:H7血清型大肠杆菌，EC130为非O157血清型大肠杆菌；RAPD分型实验结果进一步证明EC130与其他三株O157:H7血清型的菌株亲缘关系较远。 采用终浓度为0.5μg/mL丝裂霉素C对EC130、EC169进行噬菌体的诱导，以DH5作为指示菌浇注双层琼脂平板，观察到大量的噬菌斑，表明经过丝裂霉素C诱导EHEC变种释放了大量的噬菌体颗粒。 采用相对定量RT-real time PCR技术检测EC169菌株stx1基因mRNA转录水平。用CT比较法对实时荧光定量RT-PCR结果进行分析。为消除由于模板量等造成的误差，选用16s rRNA作为内标基因进行均一化处理，比较EC169和对照株EC1的stx1mRNA的相对表达量。结果显示EC169菌株中stx1mRNA未见表达。证明EC169的stx1基因不能够正常转录。 将对照株EC1及EC169的stx1及其上游调控基因q基因进行PCR扩增及克隆测序，，其中EC169stx1基因上游序列由hiTAIL-PCR扩增得到。对测序结果进行分析，EC1、EC169的stx1基因与日本Sakai标准株的同源性均为99%，stx1启动子并未发现突变或缺失，由此可知EC169不表达志贺毒素并不是因为stx1基因本身的突变或启动子无功能导致的。EC1的q基因与日本Sakai标准株的同源性为100%，而EC169则有6个SNP位点。 通过PCR扩增得到EC1和EC169的q基因序列，测序鉴定后分别克隆至原核表达系统pET-28b(+)上；CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导Q蛋白表达，最后与EC1、EC169的全菌蛋白一起进行SDS-PAGE分析。结果显示经IPTG诱导后的Q蛋白表达量明显提高，EC1、EC169的全菌蛋白在同样的位置也有条带，证明Q蛋白在EC1、EC169中都有表达。 实验结果初步证明EHEC变种EC169、EC130可诱导出完整的噬菌体，释放的Stx噬菌体仍有可能再次溶源和感染大肠杆菌，形成新的病原菌并表达志贺毒素。EC169的q基因存在突变位点，可能造成Q抗终止蛋白活性微弱，从而使下游的stx1基因不能正常转录和表达。本文为进一步研究携带stx基因不能表达志贺毒素的EHEC变种的调控机制和致病性提供了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉工业学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378
【参考文献】
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本文编号：1350731
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