NR1-TfR融合表位疫苗的制备及免疫反应的实验研究

发布时间：2017-12-30 13:03

本文关键词：NR1-TfR融合表位疫苗的制备及免疫反应的实验研究　出处：《泸州医学院》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：谷氨酸N－甲基－D－天冬氨酸受体(N-Methyl-D-Asparate Receptor，NR)广泛参与神经发育、突触可塑性、学习记忆、缺血性脑损伤和癫痫等生理病理过程，在中枢神经系统中起着重要作用。目前己知的NR拮抗剂或阻断剂大部分是人工合成的小分子药物，容易通过血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）；但其作用选择性低、常引起严重毒副作用：意识模糊、焦虑不安、幻觉等，并且难以超早期用药，因此难以进入临床。NR1是NR的基本功能亚单位，，具有NR的所有电生理和药理学特性。抗转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26被认为是迄今最有前途的脑转运载体，NR1抗体借助转铁蛋白受体（Transferrin receptor,TfR）可能可以透过血脑屏障在中枢神经系统中发挥干预治疗作用。因此NR1-TfR重组基因口服疫苗有望成超早期治疗脑损伤、机体应激、疼痛等的可行方法之一。本研究拟用前期实验构建的NR1-TfR单克隆表位的优势克隆融合蛋白表达载体pcDNA3.1-NR1/TFR（vector-S）制备NR1-TfR重组基因表位疫苗，SD大鼠口服免疫后研究该疫苗在正常大鼠体内的免疫反应。方法：（1）vector-S在真核细胞HEK293内的正确表达：vector-S转染HEK293细胞，细胞免疫荧光和western-blot分析细胞表达产物，鉴定vector-S在HEK293细胞内的正确表达；（2）制备NR1-TfR融合表位疫苗：vector-S经电穿孔方法转入减毒鼠伤寒沙门杆菌（SL7207）,经Amp抗性筛选、基因测序确定vector-S成功转入SL7207内，由此获得含vector-S的细菌SL7207（命名为SL7207-S）。OD600≈0.8时运用平板菌落计数方法计数SL7207-S的细菌含量，以此制备0.5X109cfu/ml、1X109cfu/ml疫苗单位的口服疫苗；（3）NR1-TfR融合表位疫苗在SD大鼠体内的免疫反应的研究：SD大鼠按实验要求经灌胃法口服疫苗，两周内共免疫四次。在此期间观察各组大鼠生长状态，有无腹泻、死亡等现象。取小肠组织（空肠）进行免疫组织化学分析肠道粘膜免疫反应；以HEK293稳定表达的vector-S蛋白作为已知抗原，细胞免疫荧光分析检测血清和脑脊液中抗体的表达。口服免疫一个月后检测抗体在体内持续存在的情况；结果：1）以商品化抗体NR1、OX26作为一抗，细胞免疫荧光检测转染了vector-S的细胞HEK293可显示红色荧光；western-blot检测其细胞产物在marker2KD-8KD范围内见有目的条带；2) SL7207-S菌种质粒S经基因测序证实其氨基酸序列与vector-S序列一致,平板菌落计数当OD600≈0.8时SL7207-S细菌含量为1.6X107cfu/ml;3)各组大鼠口服疫苗后生长状态良好，未见腹泻、死亡等现象；4）小肠免疫组织化学结果示空白组肠道粘膜细胞内无棕色物质表达，而NR1-TfR-1组（0.5X109cfu/ml）、NR1-TfR-2组(1X109cfu/ml)均有棕色物质表达；5）细胞免疫荧光结果显示空白对照组大鼠血清、脑脊液作为一抗时HEK293未显示出红色荧光；NR1-TfR-1组、2组血清作为一抗时HEK293均显示出红色荧光；NR1-TfR-1组脑脊液作为一抗时HEK293无红色荧光而NR1-TfR-2组显示出红色荧光，6）免疫一个月后重复检测方法显示NR1-TfR-2组肠道粘膜细胞内仍有棕色物质表达；NR1-TfR-1组血清作为一抗HEK293红色荧光显示较弱，而NR1-TfR-2组血清、脑脊液作为一抗HEK293红色荧光仍明显存在；结论：1）vector-S在真核细胞HEK293内能正确表达其目的蛋白，符合后续动物实验设计要求；2）成功获得SL7207-S菌种并制备所需的两种疫苗单位的口服疫苗；3）NR1-TfR口服疫苗在SD大鼠体内口服安全，无明显的细菌毒副作用；4）NR1-TfR重组疫苗成功启动SD大鼠肠道粘膜免疫系统；5）两种浓度的口服疫苗均能诱导大鼠产生循环抗体anti-NR1抗体，1x109cfu/ml的NR1-TfR重组疫苗产生的抗体可透过血脑屏障进入脑脊液；6）anti-NR1抗体在肠道粘膜细胞、血清和脑脊液内至少持续存在一个月以上；
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【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.11

【参考文献】