NMDA受体NR2B亚基在严重创伤应激大鼠下丘脑中的表达变化及初步机制研究

发布时间：2017-12-30 20:04

本文关键词：NMDA受体NR2B亚基在严重创伤应激大鼠下丘脑中的表达变化及初步机制研究　出处：《第三军医大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：机体在严重创伤后，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)的激活通过分泌糖皮质激素对免疫、炎症反应以及代谢的调节，对机体起着保护性作用。然而，过度而持久的HPA轴活化则可能会引起严重的继发性伤害。多篇文献报道了严重烧伤、创伤及重症患者糖皮质激素持续性增高，并且与患者的预后密切相关。因此，如何防止HPA轴过度激活所导致的继发性伤害就成为了临床上治疗严重创伤所需要解决的关键问题。谷氨酸及其离子型NMDA受体(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)参与了多种中枢神经系统生理和病理活动如突触可塑性，学习记忆，脑缺血，癫痫等。研究表明谷氨酸离子型NMDA受体尤其是NR2B亚基高度表达于下丘脑室旁核(Paraventricular nucleus，，PVN)及视上核神经元中。随着研究的深入， NR2B亚基对NMDA受体功能发挥及其在下丘脑PVN神经元兴奋性调节中的作用引起了学者的广泛关注。同时，在严重创伤后下丘脑室旁核神经元释放的促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasing Hormone，CRH)及其受体的表达也明显增高，在HPA轴活性调节及血液中糖皮质激素的升高中发挥着十分重要的作用。此外有研究发现，急性应激反应能够引起PVN神经元NMDA受体亚基的表达发生变化，并且CRH可能对这一变化有着重要作用。但是，目前对于严重创伤后下丘脑NMDA受体亚基表达的变化及其在HPA轴活化状态变化中的作用，以及作为应激反应中关键激素的CRH是否参与了严重创伤后NMDA受体亚基表达的调控，尚不十分清楚。现用的创伤模型主要包括枪弹伤，爆炸伤，撞击伤及烫伤，因枪弹伤，爆炸伤，撞击伤对致伤条件及参数难以精确控制，所得到的动物模型在损伤程度，损伤部位等不统一，不利于创伤后应激反应的研究。故本实验采取国际上常用的致伤部位及程度易控制的30％体表面积背腹部皮肤Ⅲ度烫伤模型为严重创伤模型。利用放射免疫法测定血清中皮质醇浓度，反应严重烫伤后大鼠HPA轴活性变化，并采用免疫组织化学及western印迹方法观察大鼠下丘脑组织NMDA受体NR1，NR2B亚基表达变化。此外，为了进一步证实CRH对严重烫伤后大鼠下丘脑NMDA受体NR1，NR2B表达的调控作用，采取大鼠侧脑室内置管注射的方法，观察不同浓度的CRH及其拮抗剂CP154,526对大鼠NR2B亚基表达水平的影响，分别运用了RT-PCR及免疫组织化学方法检测了NMDA受体NR1及NR2B的RNA及蛋白表达水平。主要结果及结论如下： 1.严重烫伤后大鼠血清皮质醇浓度升高，在烫伤后6h时最明显，伤后48h仍然维持在较高的浓度，而这一作用可以被CRH受体1拮抗剂CP154,526和NMDA受体拮抗剂MK-801部分拮抗。在注射CP154,526和MK-801组血清皮质醇浓度较6h时明显下降。血清皮质醇浓度升高反应在侧脑室注射CRH时也同样出现。与正常生理盐水组大鼠血清皮质醇浓度44.5±4.6ng/ml相比较，侧脑室注射注射CRH后血清皮质醇的含量明显增加199.5±18.4ng/ml，并且随着CRH浓度增高而升高，而CP-154,526能够拮抗这一反应所拮抗。这就说明CRH与NMDA受体信号通路可能在严重烫伤后HPA轴兴奋持续性增高中发挥着重要的作用。 2.下丘脑免疫组织化学染色及western-bloting检测结果显示： NR1亚基在严重烧伤后表达增加，尤其以24小时最为明显，一直持续到48h。而在注射CP154,526组却没有明显的增加。NR2B的表达出现了与NR1相反的结果，在6小时显著减少，而后出现表达增加。同时，与伤后6h相比较注射CP154,526组NR2B的表达量增加。这就说明严重烫伤后CRH的表达增加可能引起NR2B表达减少，而这一作用可以被CP154,526所逆转，进而说明CRH对NR2B的下调可能是HPA轴兴奋性升高的机制之一。 3.通过RT-PCR方法检测了各组侧脑室注药后下丘脑NR2B的表达情况。与注射生理盐水组，注射CP154,526组及CRH+CP154,526组下丘脑NR2B的表达没有明显的变化，但在低浓度及高浓度CRH组却明显下降，且有随着CRH浓度升高而降低的趋势。同时，为了进一步阐明CRH对下丘脑NR1表达的影响，本实验也对下丘脑NR1的表达进行了检测，与注射生理盐水组相比较，注射CRH组NR1的表达没有明显的变化。进一步的NR2B免疫组化染色结果也提示NR2B的表达随着CRH的浓度升高而减少，说明NR2B受到CRH的调控。综上所述，大鼠严重烧伤后NMDA受体亚基NR1及NR2B发生明显变化。进一步通过侧脑室置管注药的方法证实，CRH对NR1的表达无明显调控作用，而对NR2B亚基的表达起着负性调控作用。结果提示，大鼠严重烧伤后CRH对NR2B的调控可能是应激反应启动和维持重要的重要中枢机制之一，抑制或阻断CRH受体可能对过度应激反应的防治有着重要临床意义。
[Abstract]:The activation of hypothalamic - pituitary - adrenal cortical axis ( HPA ) plays a protective role in immune , inflammatory reaction and metabolic regulation after severe trauma . However , excessive and lasting HPA axis activation may cause severe secondary injury . NMDA receptors ( NMDA ) are involved in physiological and pathological activities of central nervous system such as synaptic plasticity , learning memory , cerebral ischemia , epilepsy , etc . Studies have shown that NMDA receptors , especially NR2B subunit , are highly expressed in paraventricular nucleus ( PVN ) and supraoptic nucleus neurons . At the same time , the expression of corticotropin - releasing hormone and its receptor released by paraventricular nucleus neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus after severe trauma plays an important role in the regulation of HPA axis activity and the increase of glucocorticoid in the blood . In order to further confirm the regulation of the expression of NMDA receptor NR1 and NR2B in the hypothalamus of rats after severe burn injury , the effects of the different concentrations on the expression of NMDA receptor NR1 and NR2B in rat hypothalamus were observed by radioimmunoassay . The main results and conclusions are as follows : Compared with normal saline group , the levels of serum cortisol increased by 199.5 卤 18.4 ng / ml , and CP - 154,526 was able to antagonise this response . 2 . The results of immunohistochemistry and western - bloting test showed that the expression of NR2B increased after severe burns , especially in 24 hours . The expression of NR2B increased . At the same time , the expression of NR2B increased significantly after 6 hours . 3 . The expression of NR2B in hypothalamus was detected by RT - PCR . There was no obvious change in the expression of NR2B in the hypothalamus , but in low and high concentrations , the expression of NR2B in hypothalamus was significantly decreased . In conclusion , the NMDA receptor subunits NR1 and NR2B after severe burn in rats have changed significantly .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R338

【参考文献】