FcγRs在ITP中的表达及调控研究

发布时间：2017-12-30 21:50

本文关键词：FcγRs在ITP中的表达及调控研究　出处：《山东大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：人Fcγ受体系统由活化性受体(FcγRⅠ,Ⅱa,Ⅲ)和抑制性受体(FcγRⅡb)两个家族组成,这两类作用相反的受体平衡一旦失调会导致许多自身免疫性疾病的发生。抗原-IgG免疫复合物(immune complex, IC)通过作用于免疫细胞上IgG恒定区Fcγ受体诱发多种免疫反应。根据RNA剪接异构体和蛋白结构不同,人类FcγR系统可分为FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ三个亚群。FcγRⅠ又称CD64,为高亲和力的IgG受体,主要表达与单核细胞和巨噬细胞；FcγRⅢ即CD16,与单体IgG结合力较弱,但同IgG聚合体有中低度的亲和力,其主要表达于中性粒细胞、单核／巨噬细胞、自然杀伤细胞；FcγRⅡ又称CD32,按功能可进一步分为FcγRⅡa和FcγRⅡb两个亚型,为低到中亲和力的IgG受体,主要与聚合的IgG结合,表达于中性粒细胞、单核／巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells, DCs)、B细胞和血小板。按功能学分类,人FcγR系统可分为活化性FcγR和抑制性FcγR两个家族。FcγRⅡb为唯一抑制性的Fcγ受体,主要通过自身分子胞浆区偶联含有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)传递抑制信号,在固有免疫和适应性免疫方面发挥重要负性调节作用；其余的FcγRⅠ、Ⅱa、Ⅲ均为活化性Fcγ受体,大都通过偶联含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif, IT AM)的γ二聚体传递活化信号。Fcγ受体信号通路在多种自身免疫性疾病的发生及进展中发挥重要作用。多篇报道显示：在风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)等自身免疫性疾病中,往往可以发现活化性受体FcyRI的表达下调及抑制性受体FcyRIIb的表达上调,故活化性和抑制性Fcy受体失衡在自身免疫性疾病的发病过程中发挥重要作用。原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP),以往亦称为特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),是临床最为常见的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30%。ITP临床表现为皮肤粘膜出血,月经过多,内脏出血,甚至颅内出血,严重影响人类健康。其发病机制主要为机体自身免疫耐受失衡,产生了针对血小板糖蛋白(glycoprotein, GP)特异性的自身抗体,大部分主要为针对GPⅡb/Ⅲa和／或GPⅠb/Ⅸ的IgG,该抗体与血小板膜自身GP抗原结合,通过作用于单核巨噬细胞Fcy受体(Fcγreceptor, FcyR)在网状内皮系统被巨噬细胞吞噬而过度清除。自身抗体的产生、激活、维持由表达FcγR的免疫细胞共同参与完成,是众多自身免疫性疾病的共同病理生理基础。除上述经典的抗体介导的血小板异常破坏途径外,多种细胞免疫机制异常,如Th1/Th2失衡、Th17亚群异常、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介导的血小板破坏、调节性T细胞数量或抑制功能异常等参与了ITP发病的异常病理生理过程,但上述异常的具体原因亟待明确。目前,对于ITP的治疗以糖皮质激素、脾切除、大剂量丙种球蛋白、免疫抑制剂等治疗为主,容易产生感染、骨髓抑制等副作用,约有1/3的患者对上述治疗无效,成为难治性ITP,常常迁延不愈,甚至危及生命。因此,深入了解ITP的发病机制,探讨阻断ITP特异发病途径并寻找新的药物作用靶点对展新的ITP的治疗策略有重要意义 ITP是最经典的一种Fcy受体介导的自身免疫性出血性疾病。做为FcγRs系统中唯一的抑制性受体,FcγRⅡb在ITP的免疫负性调节中发挥重要作用。Ashi最近报道显示：对清除幽门螺杆菌疗法有反应的ITP患者中,可以发现单核细胞抑制性受体FcγRⅡb的表达上调及活化性受体FcγRⅡa、FcyRⅠ的表达下调,而清除幽门螺杆菌疗法无反应的ITP患者中并不伴有该种变化,这提示幽门螺杆菌清除后可以通过恢复FcγRs受体平衡来缓解ITP病情。动物实验亦证实：过表达FcγRⅡa的转基因小鼠可显著加重抗体介导的血小板减少。此外,FcγRⅡa、Ⅱb亦参与抗体、补体介导的炎症反应：Shushakova研究显示C5a可直接上调肺泡巨噬细胞FcγRⅡb的表达。小鼠模型中,可溶性抗原特异的IgG可成功治疗ITP。大剂量丙种球蛋白静脉滴注(intravenous immunoglobulin, IVIg)已成功用于人类包括ITP在内的多种自身免疫性疾病中,且疗效机制研究发现IVI可上调抑制性FcγyRⅡb活性并下调激活性FcγRⅡa活性。口服大剂量地塞米松(high dose dexamethasone, HD-DXM)冲击疗法是当前皮质激素治疗ITP的研究热点,其疗效逐渐得到了广泛认可,尤其是治疗初治ITP患者。最近ITP国际工作组已将HD-DXM作为初诊ITP的标准一线疗法,但其疗效的具体机制尚不明确。初步研究证实：它可抑制抗体生成及减轻抗原抗体反应、改善毛细血管通透性、刺激骨髓造血及血小板向外周血的释放、恢复Th1/Th2平衡、增加Tregs数量等。迄今为止,尚未有系统的关于ITP患者与健康对照外周单核及B细胞上FcγRs表达及HD-DXM对ITP患者Fcγ受体系统影响的报道。目的：检测初诊活动性ITP患者及健康对照外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表达及FcγRⅡ的亚型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表达；研究HD-DXM治疗后ITP患者FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表达变化、FcγRIIa/IIb mRNA及蛋白表达变化；检测ITP患者治疗前后单核／巨噬细胞对致敏自身血小板吞噬能力变化及Th1/Th2细胞因子平衡变化；体外检测ITP患者单核细胞在DXM存在情况下培养时FcγRⅡa/Ⅱb mRNA表达变化,探讨HD-DXM影响FcγRs系统变化的可能机制。材料和方法： (1)外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表达及FcγRⅡ的亚型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表达检测部分,抽取23例初诊活动性ITP患者治疗前、治疗后2周及20例健康对照的外周血,分离血浆及单个核细胞。 (2)流式细胞仪染色法测定外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表达；免疫磁珠阳性分选外周血CD14+单核细胞；实时定量聚合酶链反应(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)检测单核细胞FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表达；免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)和western blotting检测FcγRⅡa、Ⅱb的蛋白表达；酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)检测ITP治疗前后及正常对照血浆中IFN-γ、IL-4的水平。 (3)体外实验部分抽取14例治疗前ITP患者外周血做细胞培养。免疫磁珠阳性分选外周血CD14+单核细胞,加入不同剂量的DXM培养16h, real-time RT-PCR检测FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表达变化； (4)抽取10例健康对照、10例ITP患者治疗前及治疗2周后外周血,贴壁法分离外周血单核细胞并刺激,与CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)探针标记过的致敏自身血小板在37°C或4°C共培养,流式细胞仪检测血小板被自身单核／巨噬细胞吞噬情况,应用MFI37℃/MFI4℃做为吞噬指数以判定吞噬能力。结果： (1)流式测定的FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ表面分子表达高低以平均荧光强度表示(mean fluorescence intensity, MFI),结果显示：①初诊ITP患者单核细胞表面分子FcγRⅠ表达(504.6±58.6)显著高于正常对照(309.8±52.9；P0.001)；经HD-DXM治疗后2周,FcγRⅠ表达较治疗前显著降低(317.5±69.4；P0.001)：FcγRⅠ在治疗后与正常对照组无显著差异(P0.05)。②单核细胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ在ITP组治疗前(FcγRⅡ82.6±160; FcγRⅢ9.9±4.6)、治疗后(FcγRⅡ75.4±18.9; FcγRⅢ8.9±3.0)及正常对照组(FcγRⅡ83.2±16.3; FcγRⅢ9.3±3.2)之间无显著差异(FcγRⅡP=0.947; FcγRⅢP=0.694; ANOVA).③B细胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)在ITP组治疗前(82.3±13.0)治疗后(82.7±11.8)及正常对照组(83.2±12.1)之间差异无显著性(P=0.954；ANOVA). (2)单核细胞FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA和蛋白表达：①real-time RT-PCR结果：我们应用FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA的比率变化表示HD-DXM对FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA表达的影响。初诊ITP患者FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值为5.88±5.12,与正常对照组存在显著差异(0.31±0.29；P0.001)；接受HD-DXM治疗后FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值(0.61±0.86)较治疗前显著降低(P0.001)。②western blotting结果：应用相对光密度值高低来代表FcγRⅡa和FcγRⅡb蛋白表达量。初诊ITP患者单核细胞FcγRⅡa表达量接受HD-DXM治疗后显著降低(2.05±0.81 vs 1.07±0.96, P 0.001, Student(?) test),并伴有FcγRⅡb表达的显著升高(0.13±0.31 vs 1.23±1.25, P 0.001, Whitney U test) (3)ITP患者HD-DXM治疗后单核／巨噬细胞FcγR介导的吞噬致敏血小板能力的改变。应用CMFDA做探针标记血小板,初诊ITP患者吞噬指数为(MFI ratio:3.5±0.7),显著高于正常对照(2.2±0.5；P0.05)。HD-DXM治疗后吞噬指数降为(MFI ratio:2.6±1.0),较治疗前有显著差异(P0.05)。 (4)ITP患者治疗前后血浆IFN-γ、IL-4水平变化。初诊ITP患者治疗前Thl系列细胞因子IFN-γ较正常对照显著增高(62.7±13.0 vs 37.4±4.8 pg/ml, P 0.001)和IL-4的显著降低(8.9±2.7 vs 18.3±4.7 pg/ml, P 0.001). HD-DXM治疗后,IFN-γ水平较治疗前显著降低并伴有IL-4的显著升高(IFN-γ:40.3±11.0 pg/ml, P 0.001; IL-4:18.5±4.2 pg/ml, P 0.001). (5)DXM对ITP患者体外培养单核细胞FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表达的影响。体外培养ITP患者的单核细胞在加入DXM后出现FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表达的同时上调,这种效应在DXM为1μM时最明显。在DXM为0.5μM和1μM时,FcγRⅡb mRNA表达上调的幅度要高于FcγRⅡa的幅度(P0.05)。结论： (1)初诊活动性ITP患者外周血单核细胞呈现活化性FcγRⅠ、FcγRⅡa的表达升高,及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表达降低； (2)ITP患者经HD-DXM治疗后2周,单核细胞出现活化性FcγRL、FcγRIIa的表达降低,及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表达升高,FcγRⅡa/Ⅱb mRNA比率恢复正常； (3)ITP患者治疗后伴随着单核细胞活化性和抑制性FcγRs受体平衡恢复,单核／巨噬细胞FcγR介导的自体致敏血小板吞噬能力降低； (4)ITP患者呈现Th1细胞极化状态,经HD-DXM治疗后,Th1/Th2失衡状态得到纠正； (5)DXM在体外可同时上调FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表达,且FcγRⅡb上调幅度更高；意义：本研究揭示HD-DXM治疗可以通过上调抑制性FcγRⅡb恢复单核细胞FcγRs系统平衡,从而缓解ITP患者症状,这提示了HD-DXM在ITP中发挥疗效的一种新的可能机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】